UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其預(yù)后判斷價(jià)值

吳李飛，郝佳潔，張彤彤，梁建偉，王 征，張 鈺，徐 昕，蔡 巖，王明榮，*，李 敏，*

（1. 安 徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院，安慶市立醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246003；2. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；3. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所腹部外科，北京 100021）

UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其預(yù)后判斷價(jià)值

吳李飛1，郝佳潔2，張彤彤2，梁建偉3，王 征3，張 鈺2，徐 昕2，蔡 巖2，王明榮2，*，李 敏1，*

（1. 安 徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院，安慶市立醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246003；2. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；3. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所腹部外科，北京 100021）

結(jié)直腸癌是世界第3大惡性腫瘤，其全球每年新發(fā)病例超過130萬，死亡人數(shù)約70萬，而在我國其發(fā)病率和死亡率均已分別達(dá)第4和第5位，且近年來發(fā)病人數(shù)呈明顯上升趨勢(shì)［1］，對(duì)人民的生命健康構(gòu)成重大威脅。目前，結(jié)直腸癌的主要治療手段是外科手術(shù)切除，術(shù)后輔助放化療等以提高根治率，但由于局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素的影響，結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間及生活質(zhì)量仍不容樂觀。為此，檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤中的分子改變，挖掘與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，探索對(duì)某種治療方法敏感個(gè)體的共同特征將可能有助于對(duì)不同生物學(xué)特征的結(jié)直腸癌患者實(shí)施個(gè)體化治療，改善預(yù)后。

UHRF1（ubiquitin-like PHD and ring finger domains 1），即泛素樣含PHD和環(huán)指域1，是近年新發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞生長有關(guān)的核蛋白基因，其編碼的蛋白又稱ICBP90/NP95，由類泛素（ubiquitin-like，UBL）模體、PHD（plant homeodomain）結(jié)構(gòu)域、鋅指模體（zinc finger motif）和SET-環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域（SET-and ring-associated domain，SRA）4部分組成［2］。UHRF1的表達(dá)與細(xì)胞的分化程度和增殖能力相關(guān)，即分化程度越低、增殖能力越強(qiáng)，UHRF1的表達(dá)水平也越高，例如外周血白細(xì)胞和中樞神經(jīng)細(xì)胞等高分化非腫瘤細(xì)胞中未見UHRF1表達(dá)，而在胎兒和成人胸腺、胎肝、睪丸和骨髓等增殖細(xì)胞中UHRF1的表達(dá)水平較高［3］。近來文獻(xiàn)報(bào)道，該蛋白在肺癌［4-5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］、前列腺癌［8］、胃癌［9］、甲狀腺癌［10］和喉鱗癌［11］等多種腫瘤組織中上調(diào)，其高表達(dá)與肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鱗癌［11］患者的術(shù)后生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，且均為獨(dú)立預(yù)后因子。

Kofunato等［12］在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)UHRF1過表達(dá)現(xiàn)象，但未就其對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后判斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。本研究采用組織微陣列聯(lián)合免疫組織化學(xué)技術(shù)（tissue microarrays and immunohistochemistry，TMAIHC）檢測(cè)結(jié)直腸癌患者癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中UHRF1蛋白的表達(dá)水平，并分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，探討UHRF1蛋白是否可作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌患者治療方式的進(jìn)一步優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

收集201例結(jié)直腸癌手術(shù)切除的腫瘤組織及其配對(duì)手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的上皮組織。全部病例于2006-2010年期間在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院收取，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為結(jié)/直腸腺癌，其中男性119例，女性82例；年齡14～91歲，中位年齡59歲；腫瘤T2、T3、T4期分別為16、118和67例；有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別為110和91例；腫瘤高、中、低分化分別為8、163和30例。其中有完整隨訪病例167例，中位生存時(shí)間為46.7個(gè)月（2.8～103.6個(gè)月）。所有患者術(shù)前均未接受放、化療等任何抗腫瘤治療。標(biāo)本取材后均進(jìn)行常規(guī)福爾馬林固定和石蠟包埋。

1.2 組織芯片制備

對(duì)組織標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行切片、HE染色，顯微鏡下閱片，選取相應(yīng)的組織蠟塊并采點(diǎn)標(biāo)記。每個(gè)病例標(biāo)記3個(gè)典型的癌組織點(diǎn)和2個(gè)正常組織點(diǎn)，利用穿刺針管將標(biāo)記好的供體臘塊中的組織移入受體臘塊，制作成組織微陣列。每張組織微陣列切片厚度為4 μm。

1.3 免疫組化染色

石蠟組織芯片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，0.1%枸櫞酸鈉緩沖液中微波加熱修復(fù)20 min；滴加一抗（鼠抗人UHRF1單抗，BD公司），并將片子置于濕盒內(nèi)4 ℃ 過夜；PBS浸洗后滴加二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒PV9000 （中杉金橋生物技術(shù)公司）中的試劑Ⅰ（增強(qiáng)劑）和試劑Ⅱ（ HRP標(biāo)記聚合物），在37 ℃孵箱中分別孵育20和30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片后鏡檢。

1.4 免疫組化評(píng)分

陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核，不同病例蛋白表達(dá)差異主要在于陽性信號(hào)強(qiáng)度的不同。根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度將評(píng)分分為4級(jí)：0分（不著色），1分（淺棕色），2分（棕黃色），3分（深棕色）。每例腫瘤及配對(duì)的手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的組織點(diǎn)均分別進(jìn)行評(píng)分，取各自最高分為最終評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析UHRF1蛋白在腫瘤組織和手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的上皮組織中的表達(dá)差異，采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn)方法分析蛋白表達(dá)改變與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier方法分析UHRF1蛋白表達(dá)與患者術(shù)后總生存時(shí)間之間的關(guān)系，進(jìn)一步通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析不同臨床病理指標(biāo)和UHRF1蛋白表達(dá)水平對(duì)患者術(shù)后生存時(shí)間的影響。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，UHRF1蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色，在不同患者腫瘤組織中的表達(dá)水平差異較大（圖1）。UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)陽性率為54.2%（109/201），其中強(qiáng)表達(dá)、中度表達(dá)和弱表達(dá)的頻率分別為15.4%（31/201）、12.4%（25/ 201）和26.4%（53/201）；而在配對(duì)的手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的上皮組織中陽性率僅為9.93%。UHRF1蛋白表達(dá)在腫瘤與正常組織之間具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 UHRF1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

我們進(jìn)一步分析了UHRF1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示UHRF1蛋白表達(dá)除了在近端結(jié)腸（回盲部、升結(jié)腸、結(jié)腸肝曲、橫結(jié)腸及結(jié)腸脾曲）、遠(yuǎn)端結(jié)腸（降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸）和直腸等不同部位的腫瘤組織中存在顯著性差異（P=0.008），遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌中的陽性率顯著高于近端結(jié)腸癌外，而UHRF1蛋白表達(dá)與其他臨床病理指標(biāo)均無顯著相關(guān)性（表1）。

2.3 UHRF1蛋白陽性表達(dá)與患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系及其獨(dú)立預(yù)后判斷價(jià)值

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，UHRF1蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)，該蛋白表達(dá)陽性患者的術(shù)后生存時(shí)間顯著短于表達(dá)陰性患者的術(shù)后生存時(shí)間（P=0.023）（圖2）。Cox回歸分析表明，UHRF1蛋白表達(dá)（P=0.008）、分化程度（P=0.011）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）為結(jié)直腸癌患者術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

3 討 論

多項(xiàng)研究顯示UHRF1在人類多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)［4-11］，參與細(xì)胞增殖［12-14］、凋亡［15-16］、細(xì)胞周期調(diào)控［17］等重要的生物學(xué)過程，并與腫瘤放化療敏感性相關(guān)［15，18-19］。Jenkins等［14］發(fā)現(xiàn)UHRF1的鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)維持泛素連接酶的活性至關(guān)重要，敲降UHRF1對(duì)人肺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，Daskalos等［4］有類似報(bào)道；而Hopfner等［20］研究顯示在人肺成纖維細(xì)胞中過表達(dá)UHRF1后接觸抑制現(xiàn)象被削弱。Li等［15］將UHRF1正義轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)UHRF1過表達(dá)可同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞自發(fā)凋亡和輻射所引起的細(xì)胞凋亡，Abbady等［16］的研究結(jié)果也支持這一現(xiàn)象。Jeanblanc等［17］研究認(rèn)為UHRF1通過與甲基化RB1基因啟動(dòng)子結(jié)合，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，參與細(xì)胞周期調(diào)控。UHRF家族所特有的SRA結(jié)構(gòu)域與半甲基化的GG位點(diǎn)有很高的親和性，使DNA在復(fù)制過程中維持甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致RASSF1［4］、CDKN2A［4，13］和BRCA1［6］等抑癌基因永久沉默。此外，Li［15］、Un［18］和Muto［19］的研究表明，UHRF1的高表達(dá)在腫瘤放化療敏感性中具有重要作用，有可能作為腫瘤放化療增敏的新靶點(diǎn)。

在我們的研究中，UHRF1在結(jié)直腸癌及其配對(duì)正常組織中的陽性表達(dá)率分別為54.2%和9.93%，前者顯著高于后者（P＜0.01）。Kofunato等［12］的研究表明結(jié)直腸癌中UHRF1表達(dá)率為65.8%（152/231），而在正常結(jié)直腸上皮中則未見UHRF1的表達(dá)。由于結(jié)直腸手術(shù)切端正常組織在包埋和切片過程中可能出現(xiàn)橫縱切面的差別，導(dǎo)致一些切片中基底層上皮細(xì)胞很少。因此我們推測(cè)，上述結(jié)直腸正常腺上皮中的表達(dá)差異可能是由于縱橫切面差異造成的，當(dāng)然也不排除這種差異可能與二者陽性標(biāo)準(zhǔn)及樣本取材位置有關(guān)。值得關(guān)注的是，我們還發(fā)現(xiàn)UHRF1的陽性表達(dá)與腫瘤位置有關(guān)，總體看來遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌的陽性率顯著高于近端結(jié)腸癌組織。另一方面，與之前在肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鱗癌［11］等研究相一致，UHRF1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P=0.023），而且是一種結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的獨(dú)立預(yù)后因子（P=0.008）。

綜上所述，UHRF1的陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差顯著相關(guān)。檢測(cè)UHRF1蛋白的表達(dá)水平變化可能有助于對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估，然而其在結(jié)直腸癌發(fā)生進(jìn)展過程中的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

［1］ Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al. Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］. Int J Cancer，2014. doi：10.1002/ijc. 29210.

［2］ Bronner C，Achour M，Arima Y，et al. The UHRF family：oncogenes that are drugable targets for cancer therapy in the near future？［J］. Pharmacol Ther，2007，115（3）：419-434.

［3］ Hopfner R，Mousli M，Jeltsch JM，et al. ICBP90，a novel human CCAAT binding protein，involved in the regulation of topoisomerase II alpha expression［J］. Cancer Res，2000，60（1）：121-128.

［4］ Daskalos A，Oleksiewicz U，F(xiàn)ilia A，et al. UHRF1-mediated tumor suppressor gene inactivation in nonsmall cell lung cancer［J］. Cancer，2011，117（5）：1027-1037.

［5］ Unoki M，Daigo Y，Koinuma J，et al. UHRF1 is a novel diagnostic marker of lung cancer［J］. Br J Cancer，2010，103（2）：217-222.

［6］ Jin W，Chen L，Chen Y，et al. UHRF1 is associated with epigenetic silencing of BRCA1 in sporadic breast cancer［J］. Breast Cancer Res Treat，2010，123（2）：359-373.

［7］ Unoki M，Kelly JD，Neal DE，et al. UHRF1 is a novel molecular marker for diagnosis and the prognosis of bladder cancer［J］. Br J Cancer，2009，101（1）：98-105.

［8］ Babbio F，Pistore C，Curti L，et al. The SRA protein UHRF1promotes epigenetic crosstalks and is involved in prostate cancer progression［J］. Oncogene，2012，31（46）：4878-4887.

［9］ Zhou L，Zhao X，Han Y，et al. Regulation of UHRF1 by miR-146a/b modulates gastric cancer invasion and metastasis［J］. FASEB J，2013，27（12）：4929-4939.

［10］ Pita JM，Banito A，Cavaco BM，et al. Gene expression profiling associated with the progression to poorly differentiated thyroid carcinomas［J］. Br J Cancer，2009，101（10）：1782-1791.

［11］ Pi JT，Lin Y，Quan Q，et al. Overexpression of UHRF1 is significantly associated with poor prognosis in laryngeal squamous cell carcinoma［J］. Med Oncol，2013，30（4）：613.

［12］ Kofunato Y，Kumamoto K，Saitou K，et al. UHRF1expression is upregulated and associated with cellular proliferation in colorectal cancer［J］. Oncol Rep，2012，28（6）：1997-2002.

［13］ Wang F，Yang YZ，Shi CZ，et al. UHRF1 promotes cell growth and metastasis through repression of p16ink（4）ain colorectal cancer［J］. Ann Surg Oncol，2012，19（8）：2753-2762.

［14］ Jenkins Y，Markovtsov V，Lang W，et al. Critical role of the ubiquitin ligase activity of UHRF1，a nuclear RING finger protein，in tumor cell growth［J］. Mol Biol Cell，2005，16（12）：5621-5629.

［15］ Li X，Meng Q，Rosen EM，et al. UHRF1 confers radioresistance to human breast cancer cells［J］. Int J Radiat Biol，2011，87（3）：263-273.

［16］ Abbady AQ，Bronner C，Trotzier MA，et al. ICBP90expression is down-regulated in apoptosis-induced Jurkat cells［J］. Ann NY Acad Sci，2003，1010：300-303.

［17］ Jeanblanc M，Mousli M，Hopfner R，et al. The retinoblastoma gene and its product are targeted by ICBP90：a key mechanism in the G1/S transition during the cell cycle［J］. Oncogene，

Expression and prognostic
value of UHRF1in colorectal cancer

WU Lifei1， HAO Jiajie2，ZHANG Tongtong2，LIANG Jianwei3，WANG Zheng3，ZHANG Yu2，XU Xin2，CAI Yan2，WANG Mingrong2，*，LI Min1，*
（1. Department of Gastroenterology， Anqing City Hospital， Affiliated Anqing Hospital of Anhui Medical University， Anqing 246003，Anhui； 2. State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Institute/Hospital， Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021；3. Department of Abdominal Surgery， Cancer Institute/Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021， China）

目的：探討泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其預(yù)后判斷價(jià)值。方法：采用組織微陣列聯(lián)合免疫組織化學(xué)（TMA-IHC）技術(shù)檢測(cè)201例結(jié)直腸癌中UHRF1蛋白的表達(dá)情況，分析其與臨床病理指標(biāo)及術(shù)后生存時(shí)間之間的相關(guān)性。結(jié)果：UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽性率為54.2%（109/201），顯著高于配對(duì)的手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的組織（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析顯示，UHRF1蛋白表達(dá)陽性患者術(shù)后生存時(shí)間短于表達(dá)陰性的患者（P=0.023）。Cox回歸分析結(jié)果表明，UHRF1蛋白是結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.008）。結(jié)論：UHRF1蛋白可能作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后判斷的分子標(biāo)志。

UHRF1；結(jié)直腸癌；分子標(biāo)志；預(yù)后判斷

OBJECTIVE:This study aimed to evaluate the expression and prognostic significance of ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1 （UHRF1） protein in colorectal cancer （CRC）.METHODS：The expression of UHRF1 in 201 CRC cases and adjacent normal tissues were detected by tissue microarrays and immunohistochemistry（TMA-IHC），then the relationship between UHRF1 protein expression and clinio-pathological parameters as well as its prognostic value were examined by statistical analysis.RESULTS：Positive expression of UHRF1 was observed in 54.2%（109/201） of CRC tissues，and the frequency in CRC was significantly higher than that in adjacent nomal tissues （P＜0.01）. Kaplan-Meier survival curves showed that CRC patients with negative expression of UHRF1 had shorter overall survival time （P=0.023）. Cox regression analysis indicated that UHRF1 protein expression was an independent prognostic factor（P=0.008）.CONCLUSION：UHRF1 might be a biomarker f or prognostic evaluation of CRC patients.

UHRF1；colorectal cancer；molecular marker；prognostic evaluation

R735.3

A

1004-616X（2015）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.007

2014-11-17；

2014-12-30

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201402003）

作者信息：吳李飛，E-mail：wulifei0556@yeah.net。*通信作者，王明榮，E-mail：wangmr2015@126.com；李 敏，E-mail：lmin0556@163.com