聯(lián)合檢測p53自身抗體與EB病毒VCA-IgA對鼻咽癌的診斷價值

彭裕輝，謝長樂，莊珊珊，張利群，許鎰洧，*

（1. 汕 頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，廣東 汕頭 515041；2. 開 平市中心醫(yī)院腫瘤外科，廣東開平 529300；3. 汕 頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院信息科，廣東 汕頭 515041）

聯(lián)合檢測p53自身抗體與EB病毒VCA-IgA對鼻咽癌的診斷價值

彭裕輝1，謝長樂2，莊珊珊1，張利群3，許鎰洧1，*

（1. 汕 頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，廣東 汕頭 515041；2. 開 平市中心醫(yī)院腫瘤外科，廣東開平 529300；3. 汕 頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院信息科，廣東 汕頭 515041）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方和東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高達20～50/10萬［1］。早期鼻咽癌患者的5年生存率高達95%，然而，晚期患者5年生存率只有不到70%［2-3］。目前，臨床上用于篩查和輔助診斷鼻咽癌的血清標志物主要是EB病毒相關抗體或DNA，但這些檢測方法的敏感度和特異度并不夠高［4］。因此，尋找高特異度和敏感度的血清標志物成為提高鼻咽癌早期診斷率和改善預后的關鍵。

研究表明，p53自身抗體在多種腫瘤中具有早期診斷價值［5］。然而，p53自身抗體在鼻咽癌診斷方面的意義并不清楚。本研究應用體外生產(chǎn)純化的p53作為抗原，檢測NPC患者血清中p53自身抗體水平，同時檢測EB病毒VCA-IgA作對比，探討p53自身抗體對NPC的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 一般資料

收集2012年5月-2014年4月汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院放療科的NPC患者242例。所有患者均經(jīng)病理學確診且入院前未接收其他治療。242例NPC患者中，男性179例，女性63例，年齡17～79歲，中位年齡51歲。按AJCC癌癥分期手冊第七版［6］進行臨床分期：I期4例，II期36例，III期141例，IV期61例；其中T1期34例，T2期74例，T3期84例，T4期50例；N0期20例，N1期64例，N2期147例，N3期11例；M0期235例，M1期7例。正常對照218例，為汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)務人員并被證實為無任何腫瘤相關疾患，年齡及性別與鼻咽癌患者盡可能匹配，其中男性134例，女性84例，年齡22～80歲，中位年齡50歲。所有標本均經(jīng)本院倫理委員會批準?？崭轨o脈采血3 mL，1 250g離心5 min分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和試劑

BioLogic DuoFlow蛋白純化系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG，中國華美公司），Imperial蛋白染色試劑和酶標儀（美國賽默飛公司），96孔酶標板（江蘇海門浩天生物器材廠），辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG（美國Santa Cruz公司），3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB，廈門英科新創(chuàng)公司），EB 病毒VCA-IgA檢測試劑盒（北京貝爾生物工程公司）。

1.3 p53 重組蛋白的表達與純化

將帶有PDONR223-TP53的質粒與Pdest17混合，加重組酶，25 ℃反應5 min，再將重組產(chǎn)物轉化DH5α菌株，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑選克隆進行測序驗證。將陽性的重組質粒Pdest17- TP53轉化rosetta2（DE3）菌株，37℃培養(yǎng)16 h后挑選單克隆用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌液濃度在測定波長600 nm的吸光度為0.6時加IPTG誘導，IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導3 h，離心收菌；菌體加結合緩沖液，懸浮菌體，超聲破菌，離心后取上清過Ni柱，經(jīng)洗滌緩沖液洗10個柱體積，再用洗脫緩沖液洗脫靶蛋白。純化蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電泳后的凝膠采用考馬斯亮藍染色（Imperial蛋白染色試劑）。

1.4 p53 自身抗體的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中p53自身抗體。將純化的p53重組蛋白用PBS稀釋到終質量濃度0.1 μg/mL，包被96孔板4 ℃過夜。棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次。每孔加入200 μL封閉液（PBST+1%牛血清白蛋白），37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次。加入1∶110稀釋的血清樣品和質控樣品（取自50例NPC患者的混合血清），每孔100 μL，每個血清樣本均作兩個平行孔，37 ℃孵育1 h，棄去孔中溶液，用PBST洗板3次；加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG，37 ℃孵育1 h，棄去孔中溶液，用PBST洗板3次；每孔加入TMB-過氧化氫尿素顯色液100 μL，置于37 ℃避光顯色15 min；加入終止液50μL，酶標儀以測定波長為450 nm，校正波長為630nm時檢測各樣品的吸光度值［即D（450）-D（630）］。218名正常對照血清D值的均數(shù)加上2個標準差為判斷臨界值（Cut-off值），高于此值為陽性，低于此值為陰性。

1.5 VCA-IgA的檢測

應用北京貝爾生物工程有限公司的EB病毒VCAIgA檢測試劑盒，操作嚴格按說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 p53重組蛋白純度的鑒定

p53重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色，結果顯示p53蛋白的純度均＞90%（圖1），說明已成功獲得高純度的重組p53蛋白。

2.2 血清p53自身抗體的檢測

血清p53自身抗體的平均滴度水平在鼻咽癌組（0.236±0.044）顯著高于正常對照組（0.048±0.036），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 p53 自身抗體檢測鼻咽癌的診斷價值

根據(jù)Cut-off值的判斷標準，p53自身抗體對鼻咽癌的診斷Cut-off值為0.120。p53自身抗體和VCA-IgA對鼻咽癌的診斷價值見表1。單獨檢測VCA-IgA的敏感度高于單獨檢測p53自身抗體的敏感度，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.099）。而當p53自身抗體和VCA-IgA聯(lián)合檢測時，診斷敏感度較VCA-IgA組明顯提高（P＜0.01）。

本研究中，有40例早期鼻咽癌患者。p53自身抗體和VCA-IgA以及兩者聯(lián)合檢測在早期鼻咽癌患者中的表達情況見表2。由表2可知，p53自身抗體和VCA-IgA在鼻咽癌患者組的陽性表達率分別為52.5%和35.0%，均高于正常對照組的陽性表達率（P＜0.01）。兩者聯(lián)合的陽性表達率達到了75.0%，高于正常對照（P＜0.01）。

2.4 p53自身抗體和VCA-IgA的陽性率與鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性

p53自身抗體和VCA-IgA的陽性率在不同性別、年齡、T分期、N分期和TNM分期的鼻咽癌患者間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3?？芍攦煞N標志物聯(lián)合檢測時，其陽性率與鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)之間亦未見明顯相關性（P＞0.05）。

3 討 論

自從Crawford等［7］首先在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)并描述了p53抗體以來，關于腫瘤自身抗原（tumor-associated antigens，TAA）和自身抗體在腫瘤患者中應用的報道不斷增加。以往的研究表明，血清p53自身抗體的表達水平在乳腺癌、肺癌和食管癌等多種腫瘤中是顯著升高的［5，7-8］。本研究以血清p53自身抗體為主要觀察對象，結果顯示p53自身抗體對鼻咽癌具有潛在的診斷價值。p53自身抗體對鼻咽癌的診斷敏感度和特異度分別為40.1%（95%CI：33.9%～46.6%）和95.0%（95%CI：90.9%～97.3%），與以往報道的有關p53自身抗體在其他腫瘤中的診斷價值較為一致［8-9］。

早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌對改善患者預后至關重要［2-3］。腫瘤自身抗體有希望作為一種有效的癌癥早期診斷方法。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因異常協(xié)同積累的過程，上游基因p53突變是早期的頻發(fā)事件。p53基因突變狀態(tài)下編碼的p53蛋白，其半衰期延長并在細胞內(nèi)堆積，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗p53蛋白的自身抗體［10］。已有研究提示p53自身抗體在癌癥發(fā)生的早期階段就已經(jīng)產(chǎn)生［8，11-12］，這一點在本研究中也得到了證實。本研究中，雖然p53自身抗體在鼻咽癌早期患者和晚期患者的陽性率差異顯示無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），然而，p53自身抗體似乎在早期患者的陽性率是更高的，而且，p53自身抗體在早期鼻咽癌患者的陽性率高于VCAIgA的陽性率（表2），這些結果提示p53自身抗體極有可能成為一種早期篩查鼻咽癌的標志物。但是，本研究中早期鼻咽癌患者的例數(shù)相對較少，因此，在未來的研究工作中，應該進一步在大列隊的早期鼻咽癌患者中進行驗證。

在本研究中，VCA-IgA對鼻咽癌的診斷敏感度低于Chang等［13］的研究報道，這可能與檢測的人群不同有關。顯然，VCA-IgA單獨檢測用于篩查鼻咽癌的敏感度是不夠的。作為篩查試驗，高敏感度應該是一個先決條件，以便潛在的患者不被漏檢，在這種情況下，作為一種權衡，增加敏感度而稍微降低特異度是能夠被接受的。p53自身抗體作為一種分子標記物而非傳統(tǒng)的EB病毒標志物，與VCA-IgA的聯(lián)合檢測明顯提高了鼻咽癌的診斷敏感度，達到了69.4%（95%CI：63.1%～75.0%），而特異度仍然保持在90.8%（95%CI：86.0%～94.2%）。這些結果提示p53自身抗體可作為VCA-IgA的一種補充，用于鼻咽癌的篩查。目前，臨床上通過檢測EBV-DNA用于篩查鼻咽癌的敏感度和特異度分別可以達到89.1%和85.0%［14］，敏感度高于本研究中p53自身抗體和VCA-IgA的聯(lián)合檢測，但檢測EBV-DNA費用高，部分醫(yī)院技術條件不夠，尚未能開展，而檢測p53自身抗體和VCA-IgA的方法為ELISA，方法上經(jīng)濟上更可行，更適用于人群中的篩查。

總之，本研究首次評價了p53自身抗體在鼻咽癌中的診斷價值，研究結果揭示了p53自身抗體有可能成為鼻咽癌早期診斷的標志物，p53自身抗體和VCAIgA的聯(lián)合檢測可能有助于鼻咽癌的篩查和診斷，為鼻咽癌的臨床診治提供新方法。

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Combined analysis of autoantibodies against p53and Epstein-Barr virus VCA-IgA for improved diagnosis of nasopharyngeal carcinoma

PENG Yuhui1，XIE Changle2，ZHUANG Shanshan1，ZHANG Liqun3，XU Yiwei1，*
（1. Department of Clinical Laboratory， Tumor Hospital of Shantou University Medical College， Shantou 515041； 2. Department of Surgical Oncology， Kaiping Central Hospital， Kaiping 529300；3. Department of Information， Tumor Hospital of Shantou University Medical College， Shantou 515041， Guangdong， China）

目的： 探討聯(lián)合檢測p53自身抗體與EB病毒VCA-IgA在鼻咽癌患者中的診斷意義。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測242例鼻咽癌患者和218 例正常對照者血清中p53自身抗體和EB病毒殼抗體（VCA-IgA）的表達水平。結果：血清p53自身抗體的水平在鼻咽癌患者組明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。p53自身抗體和VCA-IgA對鼻咽癌的診斷敏感度分別為40.1% （95%CI：33.9%～46.6%） 和47.5%（95%CI：41.1%～54.0%）；特異度分別為95.0%（95%CI：90.9%～97.3%）和95.4% （95%CI：91.5%～97.7%），兩者聯(lián)合檢測的敏感度和特異度分別為69.4%（95%CI：63.1%～75.0%）和90.8%（95%CI：86.0%～94.2%）。p53自身抗體、VCA-IgA和兩者聯(lián)合檢測在早期鼻咽癌患者中的陽性表達均明顯高于正常對照組（P均＜0.01）。p53自身抗體的陽性表達率與鼻咽癌患者的性別、年齡、T分期、N分期和總TNM分期之間均無明顯相關性（P＞0.05）。結論：血清p53自身抗體作為一種潛在的診斷標志物，與VCA-IgA聯(lián)合檢測可能有助于篩查和診斷鼻咽癌。

p53；自身抗體；EB病毒；VCA-IgA；鼻咽癌；診斷

OBJECTIVE:To evaluate the diagnostic value of serum autoantibodies against p53 in patients with nasopharyngeal carcinoma.METHODS：The study included 242 patients with NPC and 218 normal controls. Serum levels of autoantibodies against p53 and classical Epstein-Barr virus VCA-IgA were measured by Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.RESULTS：Serum levels of autoantibodies against p53 were significantly higher in NPC than in normal controls （P＜0.01）. Measurement of autoantibodies against p53 and VCA-IgA demonstrated a sensitivity/specificity of 40.1% （95%CI：33.9%-46.6%）/95.0% （95%CI：90.9%-97.3%） and 47.5% （95%CI：41.1%-54.0%）/95.4% （95%CI：91.5%-97.7%），respectively. The combination of autoantibodies against p53 and VCA-IgA yielded an enhanced sensitivity of 69.4% （95%CI：63.1%-75.0%） and a similar specificity of 90.8% （95%CI：86.0%-94.2%）. Moreover，detection of autoantibodies against p53 could differentiate early stage NPC patients from normal controls. The positive rate of autoantibodies against p53 was not significantly related to age，gender，T stage，N stage or overall stage （P＞0.05）.CONCLUSION：Autoantibodies against p53 might be used as a potential biomarker supplementary to VCA-IgA for screening and diagnosis of NPC.

p53；autoantibody；Epstein-Barr v irus；VCA-IgA；nasopharyngeal carcinoma；diagnosis

R730.4

A

1004-616X（2015）01-0026-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.006

2014-10-11；

2014-12-07

廣東省科技計劃項目（2013B021800250）；汕頭市醫(yī)療科技計劃項目（汕府科［2013］88號）

作者信息：彭裕輝，E-mail：pengyuhui666@163.com。*通信作者，許鎰洧，E-mail:yuwei512@126.com