PEBP1在大鼠脊髓損傷后的表達和意義

鐘占瓊 馬鵬云 曾 茜 張 婷 楊 拯 王廷華 張 曉△

1（成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗中心，成都610500）

2（四川大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)疾病研究室，成都610041）

3（昆明醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所，昆明650504）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種致殘率高的脊柱脊髓疾患，嚴重威脅到人類健康、影響人們的生活及就業(yè)情況。SCI所引起的并發(fā)癥也是臨床治療上的一大難點，往往會出現(xiàn)炎癥，細胞凋亡，感覺和運動功能降低或消失等一系列的變化。因此，脊髓損傷后，減少并發(fā)癥可能會成為治療脊髓損傷的關(guān)鍵步驟之一。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1（PEBP1）是一種廣泛表達的具有高度保守的特殊調(diào)控因子。PEBP蛋白家族已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)20多年。PEBP家族共有4個亞類，包括PEBP1-4。其中，PEBP1又稱RKIP，在人體的心、肺、腦、肝和睪丸等組織中的胞質(zhì)與胞膜中表達。PEBP家族參與多種信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。PEBP1 是 Raf-1／MEK／ERK，IKK／IKB／NF-kB，GRK-2信號通路中的關(guān)鍵因子，PEBP1通過選擇性地調(diào)節(jié)c-Raf-1而不是通過調(diào)節(jié)b-raf，激活MAPK信號分子對于生長因子的反應(yīng)，在生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。另外，PEBP1是癌轉(zhuǎn)移中的抑癌基因，PEBP1也參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、胞膜的生成及精子的發(fā)生等生理過程有關(guān)，在生長、增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生和癌癥轉(zhuǎn)移中具有重要作用。然而，PEBP1在正常大鼠脊髓中表達還不清楚，并且，在脊髓損傷之后的表達也未見報道。本實驗研究PEBP1在正常脊髓組織中的定位表達和在脊髓損傷后的表達變化，探討可能的作用機制。因此，研究PEBP1在脊髓損傷后的變化情況，可以為脊髓損傷后的分子治療和基因治療提供新的靶點，具有重要的臨床意義。

1 材料及方法

1．1 實驗動物

健康成年Sprague-Dawley大鼠105只（由成都達碩公司提供），雌性，體重（210±20）g，單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20℃～28℃。實驗動物隨機分為假手術(shù)組（sham）和實驗組，其中實驗組包含6個亞組，動物術(shù)后分別允許存活12h、1d、3d、7d、14d和28d，每組15只。

1．2 動物模型制備

動物采用3．6%水合氯醛腹腔麻醉。俯臥位固定，背部剃毛，碘伏常規(guī)消毒。體表定位，然后于T10處縱行切開皮膚及皮下組織。剝離椎旁肌肉，暴露棘突和椎板，隨后咬除T10棘突及其椎板，暴露脊髓。用改良的Allen’s法損傷動物。即10g金屬棒在30mm處下落，砸傷脊髓，造成脊髓鈍損傷模型。假手術(shù)組只剝離椎板，暴露脊髓但不損傷脊髓。術(shù)畢，逐層縫合傷口，持續(xù)3天給予大鼠注射青霉素（80 000IU／kg·d）。術(shù)后大鼠正常進食、飲水，獨籠飼養(yǎng)。每日兩次擠壓膀胱協(xié)助大鼠排尿，直至大鼠恢復(fù)自主排尿。

1．3 組織獲取

大鼠分別在對應(yīng)的存活時間點進行取材。動物用3．6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，暴露胸腔，通過心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛。充分暴露脊髓，取出整個脊髓損傷段，并放于4%多聚甲醛中后固定，用于后期的免疫組織化學(xué)分析。而用于實時定量PCR反應(yīng)和免疫印跡反應(yīng)的脊髓損傷段標本在心臟灌注生理鹽水后立即取材并存放于-80℃冰箱。

1．4 免疫組織化學(xué)

將后固定的假手術(shù)組和實驗組動物脊髓標本進行組織脫水后，用石蠟包埋，制備石蠟切片（5μm）?？酒?h后，脫蠟，用梯度酒精水化，高壓修復(fù)5 min，自然冷卻。采用SP法，進行免疫組化染色。根據(jù)試劑盒（中杉金橋）進行一下操作。即用3%過氧化氫封閉15min，PBS液洗后用5%羊血清37℃條件下孵育15min。滴加一抗PEBP1（1∶200，Rb，博士德），4℃條件下孵育過夜。加辣根過氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG二抗于37℃條件下孵育30min后用DAB顯色。常規(guī)脫水，透明，封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟不變。

染色切片在光學(xué)顯微鏡（Motic）下觀察免疫陽性反應(yīng)的分布，圖像用Image pro-plus計算免疫陽性細胞數(shù)。

1．5 免疫印跡反應(yīng)

為了檢測PEBP1蛋白表達變化，本研究采用免疫印跡法檢測。取假手術(shù)組和實驗組動物脊髓損傷段組織，粉碎后加入適量RIPA裂解液冰上裂解和勻漿，并采用超聲進行粉粹。離心后取上清液，根據(jù)試劑盒（碧云天公司）測定總蛋白濃度。各組取等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉后，用一抗PEBP1（1∶300，Rb，博士德）和beta-actin（1∶6000，Mouse，proteintech）于4℃冰箱中過夜孵育。洗膜后加HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG（1∶50 000，中杉金橋）和羊抗小鼠IgG（1∶20 000，proteintech）二抗室溫下孵育2 h。然后根據(jù)試劑盒（凱基）采用ECL發(fā)光法。用膠片進行曝光，圖像用圖像分析軟件（Quantity One）進行灰度值測定。

1．6 實時定量PCR反應(yīng)

為了檢測脊髓損傷后PEBP1mRNA的表達變化，本研究采用聚合酶鏈式反應(yīng)。取假手術(shù)組和實驗組動物的脊髓損傷段組織，加入TRIzol裂解液體試劑并于冰上勻漿，提取總RNA。根據(jù)試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

配置含有2×PCR Mix，上游引物，下游引物，探針，PCR water nucle-free，cDNA 模板的反應(yīng)體系，并于 Real-time PCR system（BIO RAD 7300）在95℃，2min預(yù)變性；95℃，15s；53℃，20s；60℃，40 s，45個循環(huán)的條件下測試。所采用的引物由上海生工公司合成，基因序列如下，PEBP1Forwad primer sequence：5′-ATGCTCCCAGCAGGAAGGA-3′，backwad primer sequence：5′-GACAGTGCCACTGCTAAT-3′；beta-actin Forwad primer sequence：5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′， backwad primer sequence：5′-ACAGTGCCACTGCTAAT-3′。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 18．0用于數(shù)據(jù)處理。實驗結(jié)果表示為均數(shù)±標準誤。采用單因素方差分析方法（ANOVA）用于比較各組之間的差異性，采用＜0．05表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 PEBP1在脊髓中的分布和表達變化

運用免疫組織化學(xué)的方法檢測PEBP1在脊髓中的定位表達。實驗結(jié)果顯示PEBP1在脊髓后角的膠質(zhì)細胞的胞漿中有陽性表達，也有少量定位于細胞核內(nèi)。免疫陽性細胞數(shù)結(jié)果顯示脊髓損傷后PEBP1的表達在12h（＜0．001），1d（＝0．025），3d（＜0．001），7d（＝0．001），14d（＝0．006）和28d（＝0．001）降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖1）。

圖1 PEBP1在脊髓后角的定位表達Fig．1 The locoation of PEBP1in posterior horn of spinal cord

2．3 脊髓損傷后PEBP1蛋白的表達變化

為了進一步研究PEBP1的作用，采用免疫印跡實驗檢測脊髓損傷后PEBP1蛋白的表達變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組術(shù)組比較，在大鼠脊髓損傷后7d（＝0．025），14d（＝0．035）和28d（＝0．023）PEBP1蛋白的表達量降低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2）。

圖2 PEBP1蛋白脊髓損傷中表達Fig．2 The level of PEBP1protein in rats with spinal cord injury

2．4 脊髓損傷后PEBP1mRNA的表達變化

為了進一步檢測脊髓損傷后PEBP1mRNA的表達變化，我們采用的聚合酶鏈式反應(yīng)。如圖1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組（sham）比較，大鼠脊髓損傷后PEBP1mRNA表達量在12h（＜0．001），1d（＜0．001），3d（＜0．001），7d（＜0．001），14d（＜0．001）和28d（＜0．001）明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3）。

圖3 PEBP1mRNA在脊髓損傷中表達Fig．3 The relative expression of PEBP1mRNA in spinal cord after injury

3 討論

PEBP1作為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族（PEBP）的成員之一，參與細胞的生長、增殖、分化、凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及腫瘤相關(guān)等生理過程。然而，PEBP1在正常脊髓中的定位表達和在脊髓損傷后的表達變化還未見報道。本研究通過大鼠脊髓損傷模型，采用免疫組織化學(xué)的方法進行定位研究，運用聚合酶鏈式反應(yīng)和免疫印跡法檢測PEBP1 mRNA和蛋白的表達變化。

3．1 PEBP1在脊髓中的分布

本實驗通過免疫組織化學(xué)方法檢測到PEBP1在正常脊髓后角的神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞漿和胞核表達，在脊髓損傷后PEBP1免疫陽性細胞數(shù)在12h，1d，3d，7d，14d和28d降低。因此，我們推測PEBP1在脊髓損傷后的表達降低可能與脊髓損傷后感覺功能的恢復(fù)有關(guān)，這可能因為PEBP1參與脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活和凋亡有關(guān)。Burgula等將大鼠置于模擬海拔高度中5d，檢測大腦組織中PEBP1蛋白表達降低，推測PEBP1可能與癡呆癥和缺氧有關(guān)。George等通過基因表達系列分析在阿爾茲海默病小鼠模型中基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)PEBP1在阿爾茲海默癥的大腦組織中表達減少，提示PEBP1可能作為阿爾茲海默癥的標志物。在給大鼠服用冰毒后，發(fā)現(xiàn)位于突觸的PEBP1表達降低，說明PEBP1參與藥物成癮行為，因此，其可能會作為潛在的治療藥物成癮行為的靶點。結(jié)合本實驗研究，我們的結(jié)果顯示PEBP1在脊髓中有表達，在脊髓損傷后的表達降低，這與以前研究顯示在人類疾病中PEBP1的表達降低一致。PEBP1在正常脊髓后角的神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達，提示PEBP1在脊髓中對于維持正常的生理功能有重要作用。在脊髓損傷后，PEBP1的免疫陽性細胞減少可能與脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡壞死有關(guān)，這提示PEBP1可能影響脊髓損傷后感覺功能。

3．2 PEBP1mRNA和蛋白在脊髓損傷之后的表達變化

為了進一步研究PEBP1在脊髓中作用，采用實時定量PCR和免疫印跡實驗檢測PEBP1在脊髓損傷后的蛋白和基因的表達變化。實驗結(jié)果顯示PEBP1蛋白在大鼠脊髓損傷后7d，14d和28d下降，此外，PEBP1mRNA的表達水平在脊髓損傷后12h，1d，3d，7d，14d和28d降低。結(jié)果提示PEBP1在脊髓損傷后參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活和凋亡，從而影響大鼠脊髓損傷后感覺功能的恢復(fù)。

PEBP1影響細胞的分化，細胞存活以及細胞遷移等重要生理過程。Sagisaka等通過體外培養(yǎng)大鼠海馬細胞，實驗結(jié)果顯示PEBP1與海馬祖細胞向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的分化有關(guān)，提示PEBP1在海馬祖細胞分化為特定細胞系的過程中可能作為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。Zeng等的實驗結(jié)果顯示PEBP1的表達與轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)生，它主要參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，存活和遷移。另外，PEBP的在黑色素瘤中表達降低，在體內(nèi)黑色素瘤中缺失PEBP會增加細胞的侵襲性。當上調(diào)PEBP在的結(jié)腸癌細胞中表達可以抑制細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，眾多研究顯示PEBP通過參與MAPK、G蛋白偶聯(lián)受體、GSK3β和NF-κB等信號通路發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

結(jié)合本研究，實驗結(jié)果顯示在脊髓損傷后PEBP1的蛋白和基因均下降，這與以往的關(guān)于PEBP1在腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的作用一致，因此，我們推測PEBP1減少會影響脊髓的正常生理動能，從而影響脊髓損傷后的感覺功能。PEBP1通過激活 MAPKG，GSK3β和 NF-κB等信號通路影響神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活和凋亡，從而影響感覺功能的恢復(fù)。綜上所述，在脊髓損傷后，PEBP1在脊髓后角的神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞漿和胞核表達，同時PEBP1的蛋白和基因的水平下調(diào)，提示PEBP1參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的存活和凋亡，影響大鼠脊髓損傷后感覺功能的恢復(fù)。這種作用可能與MAPK，GSK3β和NF-κB信號通路有關(guān)。

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