低能激光照射對(duì)梗死后心肌微環(huán)境影響的實(shí)驗(yàn)研究*

侯劍峰，袁昕，張浩，鄭哲，胡盛壽

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

低能激光照射對(duì)梗死后心肌微環(huán)境影響的實(shí)驗(yàn)研究*

侯劍峰，袁昕，張浩，鄭哲，胡盛壽

目的：探討低能激光照射（LLLI）對(duì)梗死后心肌微環(huán)境的影響。

方法：冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作SD大鼠心肌梗死模型。3周后，經(jīng)超聲心動(dòng)圖篩選合格心肌梗死大鼠隨機(jī)分為三組：①LLLI 組：心肌梗死后開胸接受LLLI預(yù)處理（n=26）；②對(duì)照組：心肌梗死后單純開胸，日光燈照射（n=27）;③假手術(shù)組：?jiǎn)渭冮_胸，冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不行結(jié)扎（n=24）。LLLI 預(yù)處理采用635 nm 半導(dǎo)體低能激光（輸出功率：5 mW；照射時(shí)間：150秒；能量密度：0.96 J/cm2）開胸單次照射。LLLI 預(yù)處理后1小時(shí)、1天、1 周，以免疫蛋白印跡法和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法分別檢測(cè)預(yù)LLLI 處理區(qū)內(nèi)心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)，分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定LLLI 預(yù)處理區(qū)內(nèi)心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，TUNEL法檢測(cè)照射區(qū)心肌細(xì)胞凋亡，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)左心功能。

結(jié)果：LLLI顯著提高了梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達(dá)及SOD的活性，降低了MDA的含量。但未能顯著改善梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡和左心功能。

結(jié)論：LLLI能夠通過(guò)降低梗死后心肌組織氧化應(yīng)激水平改善局部微環(huán)境。

低能激光照射；心肌梗死；微環(huán)境

Methods: The myocardial infarction (MⅠ) model was established by left anterior descending (LAD) artery ligation in female rats. 3 weeks later, the qualified MⅠ rats were randomly divided for 3 groups:①LLLⅠpreconditioning group, the rats received thoracotomy for LLLⅠ by a 635nm, 5mW diode laser with the energy density of 0.96 J/cm2for 150 seconds, n=26. ②Control group, the rats received thoracotomy for daylight irradiation, n=27.③Sham operation group, the rats received thoracotomy without LAD ligation, n=24. The Expressions of myocardial vascular endothelial growth factor (VEGF), glucose-regulated protein 78 (GRP78), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were evaluate by real time-PCR, Western blot analysis and other relevant laboratory test at 1 hour, 1 day and 1 week after treatment. The myocardial cell apoptosis was examined by TUNEL staining, and left ventricular function was detected by echocardiography.

Results: LLLⅠ preconditioning obviously increased the myocardial VEGF, GRP78 expression and SOD activity, decreased MDA production; while it could not really improve the myocardial cell apoptosis at periinfarcted area and left ventricular function in experimental rats.

Conclusion: LLLⅠ preconditioning may improve the milieu of infarcted myocardium via decreasing the oxidative stress in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:47.)

低能激光照射（LLLI）療法是使用輸出功率為毫瓦級(jí)的低能量或低強(qiáng)度激光處理靶組織，在不引起組織或細(xì)胞損傷的情況下，對(duì)組織局部或全身起到刺激、調(diào)節(jié)、活化等生物刺激效應(yīng)的激光療法[1]。本研究旨在利用LLLI生物刺激效應(yīng)作為預(yù)處理策略，觀察LLLI對(duì)梗死后心肌組織微環(huán)境的作用并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法：2011-09至2013-10期間進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，均由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重260～280 g，雌雄各半。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型[2]。3周后，使用超聲心動(dòng)圖篩選大鼠心肌梗死模型[左心室短軸縮短率（LVFS）＜30%，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜60%]，將77只存活大鼠隨機(jī)分為三組：①LLLI 組（n=26）：心肌梗死后開胸接受LLLI預(yù)處理；②對(duì)照組（n=27）：心肌梗死后單純開胸，日光燈照射；③假手術(shù)組（n=24）：?jiǎn)渭冮_胸，冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不行結(jié)扎。

低能激光照射療法預(yù)處理方法：InGaAsP半導(dǎo)體低能激光治療儀，調(diào)節(jié)激光輸出模式為連續(xù)輸出模式，激光輸出波長(zhǎng)635 nm，600 μm光導(dǎo)纖維傳輸，光纖末端輸出功率5 mW，照射距離26 mm，光斑直徑10 mm，功率密度6.37 mW/cm2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)定照射時(shí)間為150 s，相對(duì)應(yīng)的能量密度為0.96 J/cm2。自制直徑為10 mm無(wú)菌碘伏紗布在激光照射時(shí)遮蓋除照射區(qū)之外其他組織，避免激光散射引起實(shí)驗(yàn)誤差。

觀察指標(biāo)：LLLI 預(yù)處理后1小時(shí)、1天、1周，以免疫蛋白印跡法（Western blotting）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法分別檢測(cè)LLLI預(yù)處理區(qū)內(nèi)心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)，分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定LLLI預(yù)處理區(qū)內(nèi)心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定法（TUNEL法）檢測(cè)照射區(qū)心肌細(xì)胞凋亡，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)左心功能。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；組間差異性比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠梗死后心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)及超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的比較

LLLI預(yù)處理對(duì)照射區(qū)域梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達(dá)、SOD的酶活及MDA的含量的不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖1所示。在預(yù)處理后1小時(shí)和1天，與對(duì)照組比較，LLLI組梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達(dá)及SOD活性均顯著提高（P＜0.05）；而MDA含量顯著降低（P＜0.05）。在預(yù)處理后1周，LLLI組與對(duì)照組的上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 低能激光照射預(yù)處理對(duì)梗死后心肌組織的影響

2.2 低能激光照射預(yù)處理對(duì)心肌梗死邊帶區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

LLLI預(yù)處理后1周，組織冰凍切片經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)：發(fā)生凋亡的細(xì)胞經(jīng)TUNEL法檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核呈黃綠色，典型圖片如圖2所示。對(duì)照組和LLLI組的凋亡細(xì)胞百分比分別為（10.3±1.9）%和（10.1±1.8）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 低能激光照射對(duì)心肌梗死邊帶區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

2.3 左心室功能評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)LLLI對(duì)心功能的改善情況，LLLI后1周對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。LLLI組與對(duì)照組比較，左心室射血分?jǐn)?shù)[（43.26±5.02）% vs（41.86±3.46）%]、左心室短軸縮短率[（17.27±2.44）% vs（16.56±1.67）%]、左心室舒張末期內(nèi)徑[（6.17±0.52） mm vs（6.24±0.50）mm]和左心室收縮末期內(nèi)徑[（7.45±0.52） mm vs（7.49±0.61）mm]，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

LLLI是經(jīng)FDA審批的無(wú)顯著危害級(jí)（NSR）物理治療設(shè)備，由于其安全性高，成本低及操作簡(jiǎn)便，LLLI物理治療已被臨床廣泛接受。既往研究顯示，能量密度為1～4 J/cm2的LLLI治療在多種疾病的治療中顯示出良好的治療效果[3,4]。在本研究中LLLI的參數(shù)設(shè)定如下：輸出功率為5 mW，照射時(shí)間為150 s，功率密度為6.37 mW/cm2，能量密度為0.96 J/cm2。通過(guò)LLLI預(yù)處理梗死后心肌組織，我們主要對(duì)LLLI進(jìn)行了兩方面指標(biāo)的評(píng)價(jià)：以GRP78，VEGF為代表評(píng)價(jià)LLLI提高照射區(qū)細(xì)胞保護(hù)因子分泌；以SOD、MDA的測(cè)定評(píng)價(jià)LLLI提高局部組織抗氧化能力作用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LLLI在細(xì)胞移植前的預(yù)處理顯著提高了照射局部組織VEGF和GRP78的表達(dá)。而VEGF和GRP78在局部心肌組織內(nèi)的提高已被證實(shí)可以在心肌缺血過(guò)程中發(fā)揮重要的心肌保護(hù)作用[5-7]。在Tuby等[8]的研究顯示，LLLI單次直接照射心肌組織，可以顯著提高急性心肌梗死后心肌組織內(nèi)VEGF和iNOS的表達(dá)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，限制了心肌梗死面積的擴(kuò)大。

我們的研究也發(fā)現(xiàn)：LLLI在細(xì)胞移植前的預(yù)處理顯著提高梗死后組織中抗氧化物質(zhì)SOD的酶活，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。在Zhu等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，以660 nm波長(zhǎng)的LLLI處理冷保存的大鼠離體心臟，能夠促進(jìn)復(fù)蘇后心臟功能的恢復(fù)，這一作用認(rèn)為與LLLI處理使心肌細(xì)胞內(nèi)ATP的含量及抗氧化酶的活性得以維持有關(guān)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，LLLI單次預(yù)處理心肌組織產(chǎn)生顯著微環(huán)境改善效應(yīng)在預(yù)處理后迅速出現(xiàn)，但在1周即消失，而且這種短暫的心肌微環(huán)境改善作用對(duì)梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡以及心功能的改善沒(méi)有顯著影響，這一結(jié)果提示我們，選擇新的組織穿透力較好的LLLI設(shè)備或是改進(jìn)LLLI預(yù)處理的技術(shù)，如設(shè)計(jì)以光導(dǎo)纖維進(jìn)行激光傳輸經(jīng)皮穿刺行LLLI心肌表面預(yù)處理的技術(shù)可能進(jìn)一步提高預(yù)處理效果。

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Effect of Low-Level Laser Irradiation Preconditioning on Milieu of Infarcted Myocardium in Experimental Rats

HOU Jian-feng, YUAN Xin, ZHANG Hao, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Ⅰnstitute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China Corresponding Author: HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To explore the effect of low-level laser irradiation (LLLⅠ) preconditioning on milieu of infarcted myocardium in experimental rats.

Low-level laser irradiation; Myocardial infarction; Milieu

2014-08-04）

（編輯：許 菁）

北京市科技新星計(jì)劃（Z111107054511080）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃（2013D009008000004）

100037北京市，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作者簡(jiǎn)介：侯劍峰 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病外科基礎(chǔ)與臨床研究 Email: hjf2006111@163.com 通訊作者：胡盛壽

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0047-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.013