急性主動脈夾層患者主動脈組織和血漿中微小核糖核酸的差異表達*

王曉建 ，黃畢，樊曉寒，蘇文君，張良，路天怡，田力，楊艷敏，惠汝太，張澍

急性主動脈夾層患者主動脈組織和血漿中微小核糖核酸的差異表達*

王曉建 ，黃畢，樊曉寒，蘇文君，張良，路天怡，田力，楊艷敏，惠汝太，張澍

目的：本研究旨在尋找新的可作為急性主動脈夾層（AAD）診斷標志物的微小核糖核酸(miRNAs)。

方法：入選4例A型AAD患者的升主動脈病變組織標本（AAD1組）和4例無心血管疾病的器官捐贈者的升主動脈組織標本（NC1組）；入選20例A型AAD患者（AAD2組）和20例無心血管疾病正常對照者（NC2組）并分別采集血漿，兩組病例對照的年齡、性別嚴格匹配。利用miRNA芯片技術(shù)，檢測四組受試者的升主動脈組織和血漿miRNAs表達譜，整合兩組分析結(jié)果，確定AAD患者組織和血漿均差異表達的miRNAs。

結(jié)果：主動脈組織miRNA芯片結(jié)果顯示，AAD患者中30個miRNAs表達顯著改變，其中13個表達上調(diào)，17個表達下調(diào)。血漿miRNA芯片分析顯示，AAD患者有93個miRNA差異表達，其中33個表達上調(diào)，60個表達下調(diào)。整合兩個表達譜，共有4個miRNAs（miR-4313、-933、-1281和-1238）在血漿和組織均顯著升高。其中，AAD1組較NC1組、AAD2組較NC2組miR-4313分別上調(diào)1.5倍和42.4倍， miR-933分別上調(diào)10.4倍和26.8倍，miR-1281分別上調(diào)1.7倍和17.8倍，miR-1238分別上調(diào)1.3倍和13.8倍。

結(jié)論：通過miRNA芯片分析，我們篩選到4個在AAD患者主動脈組織和血漿中均升高的miRNAs。這些miRNA可能是診斷AAD的生物標志物，但需大樣本驗證。

miRNA芯片；急性主動脈夾層；miRNA差異表達

Methods: Our work included 2 sets of groups.①AAD 1 tissue group, containing the aortic tissue of A type AAD patients and Control 1 group, containing the aortic tissue of the subjects without cardiovascular disease. n=4 in each group.②AAD 2 plasma group, containing the plasma of A type AAD patients and Control 2 group, containing the plasma of the subjects without cardiovascular disease. n=20 in each group. The age and gender were strictly matched between the patients and control subjects. The miRNAs expression in ascending aortic tissue and plasma were examined by microarray analysis in 4 groups, and the results in 2 sets of groups were integrated to identify the differential expression of miRNAs in AAD patients.

Results: The microarray analysis indicated that in AAD patients, the aortic tissue had 30 differentially expressed

miRNAs, 13 of them were up-regulated and 17 were down-regulated; plasma had 93 differentially expressed miRNAs, 33 of them were up-regulated and 60 were down-regulated. With integrated analysis, 4 miRNAs expressions were increased in both aortic tissue and plasma as miR-4313, miR-933, miR-1281 and miR-1238. Compared with Control 1 group and Control 2 group, AAD 1 group and AAD 2 group showed up-regulated miR-4313 at 1.5-fold and 42.4-fold, up-regulated miR-933 at 10.4-fold and 26.8-fold, up-regulated miR-1281 at 1.7-fold and 17.8-fold, up-regulated miR-1238 at 1.3-fold and 13.8-fold respectively.

Conclusion: There were 4 differentially expressed miRNAs in both aortic tissue and plasma in AAD patients, which might be the potential biomarkers of AAD, while large sample investigation is needed.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:154.)

急性主動脈夾層（AAD）是心血管疾病的危急重癥，具有發(fā)病突然、進展迅速、死亡率高的特點。由于缺乏特異的臨床表型，AAD初診誤診率往往超過25%，甚至達到50%[1-6]。診斷延誤與預后密切相關(guān)，未及時診治的主動脈夾層患者3天和2周死亡率分別高達50%和80%[7,8]。因此，提高主動脈夾層診斷水平是改善患者預后的關(guān)鍵。血漿生物標志物具有操作便捷、價格便宜等特點，在主動脈夾層診斷中被日益重視。D-二聚體、平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）、腦型肌酸激酶（CK-BB）、Calponin是已發(fā)現(xiàn)的AAD血漿標志物[9-12]。這些因子在AAD患者血漿中顯著升高，具有一定的指示意義，但由于敏感性或特異性不高，尚不能成為診斷AAD理想的生物標志物。微小核糖核酸（miRNAs）是一類長約21～23個堿基的單鏈非編碼小分子RNA，與疾病密切相關(guān)并在血漿中穩(wěn)定存在[13,14]。目前已有多個miRNA被證實為心血管疾病的分子標示物，但miRNA與AAD的研究較少。本研究擬通過分析AAD患者和正常對照者主動脈組織和外周血miRNA的表達差異，篩選可能作為AAD診斷的生物標志物，為AAD的診治提供新思路和新策略。

1 資料與方法

主動脈組織樣本的選取及采集：2011-01至2011-05期間，采集我院4例A型AAD患者（AAD1組）的升主動脈病變組織標本?；颊呔鶠槟行?，平均年齡（49.1±4.9）歲。AAD患者均經(jīng)過計算機斷層掃描攝影術(shù)（CT）確診，并排除馬凡綜合征、Loeys-Dietz綜合征及家族性主動脈夾層瘤。患者從發(fā)病至手術(shù)時間不超過24小時。術(shù)中取出典型病變組織標本，立即分為1 cm3的小塊，置于冰浴的無RNA酶凍存管中，液氮速凍，即刻轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。正常對照的組織標本來自4例無心血管疾病的器官捐贈者（NC1組），均為男性，平均年齡（47.9±6.7）歲。升主動脈組織標本的采集和保存方法同前。

血漿樣本的選取及采集：2011-01至2011-09，選取我院入選急性A型AAD患者20例（AAD2組），平均年齡（53.3±13.5）歲，男性14例（70%）；同時選取超聲心動圖和心電圖檢查確認無心血管病疾病者20例（NC2組）作為對照，男性14例（70%），平均年齡（51.9±11.2）歲。AAD患者診斷排除標準同前，且從發(fā)病至采血不超過24小時。采集兩組受試者的4 ml靜脈血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，4℃低溫離心機離心（2 000 g，10分鐘），分離血漿，-80℃儲存?zhèn)溆?。本項目全部研究?nèi)容均獲得阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會同意，所有受試者均簽署知情同意書。

總RNA提取及質(zhì)檢：①組織樣本：使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit (AM1560, Ambion, Austin, TX, USA)提取總RNA。抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) 檢測濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。AAD1組4例患者樣本和NC1組4例正常對照樣本的總RNA的OD260/OD280均在2.0～2.1之間，28 s和18 s條帶清晰，且28 s/18 s＞2。 ② 血漿樣本：從AAD2組和NC2組每個受試者的血漿中取10 μl，將各組的20位受試者血漿分別混合。使用mirVanaTMPARISTMKit(AM1556, Ambion, Austin, TX, USA) 提取血漿總RNA。Agilent Bioanalyzer 2100檢測濃度和純度。兩組的總RNA的OD260/OD280均在1.9～2.1之間。

芯片實驗：① 組織樣本：采用Agilent human miRNA （8×60 K） V16.0芯片 （Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）檢測AAD1組和CN1組組織樣本miRNA表達譜，樣本經(jīng)熒光標記后，在滾動雜交爐中與芯片雜交，采用Agilent Microarray Scanner掃描芯片結(jié)果，用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)，采用Gene Spring Software 11.0進行歸一化處理。②血漿樣本：采用Agilent human miRNA（8×60 K）V19.0芯片檢測AAD2組和NC2組血漿樣本分別混合后miRNA表達譜。所有操作同前。組織和血漿樣本的miRNA芯片實驗由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)分析包括芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析、差異表達miRNA靶基因分析。以對照組主動脈組織樣本中各miRNA表達量的數(shù)學均數(shù)為正常值，主動脈夾層患者組織樣本分別與之比較。差異表達的miRNAs的篩選標準為：表達倍數(shù)變化量（foldchange）≥1.3倍（上調(diào)）或≤0.27倍（下調(diào)），且P＜0.05。

2 結(jié)果

四組受試者的基線資料比較：AAD1組與NC1組、AAD2組與NC2組的年齡、性別完全匹配，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。AA2組較NC2組的高血壓患者比例高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，四組的動脈粥樣硬化患者比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。表1

表1 四組受試者的基線資料比較 [例（%）]

AAD1組與NC1組主動脈組織miRNA差異表達的結(jié)果：30個miRNAs在AAD1組中差異表達（圖1），13個miRNAs表達上調(diào)，17個miRNAs表達下調(diào)。miRNAs差異表達量增加或降低數(shù)倍至數(shù)百倍不等，上調(diào)量最大的miRNA是has-miR-31，較NC1組表達增加496倍，下調(diào)最大的miRNA是has-miR-936，較NC1組下調(diào)超過300（1/0.003）倍。表2

圖1 AAD1組與NC1組的主動脈組織差異表達miRNA的火山圖

表2 AAD1組與NC1組主動脈夾層組織中miRNA差異表達的miRNAs

AAD2組與NC2組血漿miRNA表達的結(jié)果: 93個miRNAs在AAD2組中差異表達，33個表達上調(diào)，60個表達下調(diào)。表達差異最顯著的有20個miRNAs（表3）。上調(diào)最顯著的是has-miR-4313，AAD2較NC2組增加42.2倍；下調(diào)最顯著的是hasmiR-4454，AAD2組僅為NC2組的1/100。

表3 AAD2組與NC2組患者血漿中miRNA差異表達最顯著的20個miRNAs

AAD1組組織差異表達miRNA與AAD2組血漿差異表達miRNA整合分析結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)了4個在組織和血漿中均差異表達的miRNAs，分別是hasmiR-4313、has-miR-933、has-miR-1281和hasmiR-1238（表4）。這4個miRNAs在AAD1組合AAD2組的組織和血漿中均表達上調(diào)，其中上調(diào)量較高的是has-miR-4313和has-miR-933。AAD1組較NC1組、AAD2組較NC2組has-miR-4313分別上調(diào)1.5倍和42.4倍，has-miR-933分別上調(diào)10.4倍和26.8倍。

表4 AAD1組和AAD2組差異表達的miRNAs整合分析結(jié)果

3 討論

本研究利用miRNA芯片分析了四組受試者的主動脈組織和血漿中miRNA表達曾找到了四個在組織和血漿中均差異表達的miRNAs。這四個miRNA既與主動脈夾層的病變密切相關(guān)，亦在外周血顯著升高，很可能成為新的AAD診斷生物標志物。

近年來，多項研究表明miRNAs在血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。全身敲除miRNAs成熟所必須的Dicer酶，小鼠在胚胎期即出現(xiàn)血管生成障礙[15]，血管平滑肌特異性敲除Dicer基因，小鼠會出現(xiàn)腹腔出血和胚胎期死亡[16]。因此，miRNAs在血管發(fā)育過程中起重要調(diào)節(jié)作用。此外，miRNAs已被證實參與血管平滑肌細胞從收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)化。過表達miR-143和mir-145可促進血管平滑肌細胞收縮表型的形成，而抑制miR-143和miR-145促進合成型表型的形成[17，18]。Leeper等[19]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21后可抑制腹主動脈瘤的進展，相反，抑制miR-21可促進腹主動脈瘤的進展[20]。

miRNAs在病灶部位的表達與疾病進程密切相關(guān)，由于其在血漿中穩(wěn)定存，病灶部位的miRNA表達改變會直接反應到外周血miRNA水平，進而可作為診斷疾病、判斷治療反應或預測預后的血清標志物[21-25]。多個miRNAs已被證實對心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭及心律失常等的診斷具有重要價值[14,26]，但miRNAs在主動脈疾病方面的研究還很少。Liao等[27]對6例主動脈夾層患者和6例正常對照通過芯片分析差異表達的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主動脈夾層患者18個miRNAs上調(diào)，56個miRNAs下調(diào)。胡孜陽等[28]對5例主動脈夾層患者和4例正常對照進行主動脈組織的miRNAs差異表達分析，發(fā)現(xiàn)主動脈夾層患者有3個miRNA表達上調(diào)，2個miRNAs表達下調(diào)。這些研究均表明在AAD的病變血管中miRNA表達發(fā)生顯著改變，但是AAD患者血漿中miRNA是否有改變，miRNA在AAD的臨床診斷及預后方面是否具有價值，目前尚不明確。

本研究首次同時分析AAD患者病變血管組織和外周血血漿中miRNA表達差異，篩選出了4個患者主動脈組織和血漿均表達上調(diào)的miRNAs。生物信息學分析提示，這些miRNAs預測的靶蛋白廣泛參與膠原、蛋白聚糖代謝、細胞信號轉(zhuǎn)導及炎癥等多個與主動脈夾層的發(fā)病機制密切相關(guān)的分子通路。因此，這些差異表達的miRNAs不僅是潛在的AAD的血清標志物，也很可能參與了AAD的發(fā)病過程。

我們的研究雖然有了明確的提示，但也存在一些局限性，例如樣本數(shù)較少、只關(guān)注了AAD發(fā)病急性期的血漿水平等。既往的研究提示，miRNA芯片技術(shù)雖然可用來高通量篩選差異miRNAs，但存在一定的假陽性，需經(jīng)大樣本的驗證以減少假陽性。將來，我們課題組將擴大樣本量，進一步驗證這些miRNAs鑒別診斷AAD的特異性和敏感性。在AAD發(fā)病的不同時間點上收集血漿，確定miRNA表達變化的時間窗。另外，值得注意的是，雖然本研究發(fā)

現(xiàn)AAD患者和正常對照miRNAs表達有差異，但距臨床應用尚有較長距離。由于影像學技術(shù)對AAD的診斷具有較高的敏感性和特異性，影像學方法診斷和排除AAD仍是首選。本研究發(fā)現(xiàn)AAD患者主動脈組織和血漿均表達上調(diào)的4個miRNAs，可能對鑒別診斷急性AAD有一定幫助，但需要更大樣本量的研究予以證實。

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Differential Expression of microRNAs in Aortic Tissue and Plasma in Patients With Acute Aortic Dissection

WANG Xiao-jian, HUANG Bi, FAN Xiao-han, SU Wen-jun, ZHANG Liang, LU Tian-yi, TIAN Li, YANG Yan-min, HUI Ru-tai, ZHANG Shu.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

Objective: We want to identify the new microRNAs (miRNAs) biomarker for diagnosing the patients with acute aortic dissection (AAD).

miRNA chips; Acute aortic dissection; miRNA differential expression

2014-06-04）

（編輯:曹洪紅）

國家自然科學基金（81170286，81300184）

100037 北京市，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室 （王曉建、惠汝太）， 心律失常中心（樊曉寒、張澍） ，急重癥中心（黃畢、田力、楊艷敏） ，心外科（張良、蘇文君、路天怡）

王曉建 副研究員 博士 主要從事心血管疾病遺傳學及轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究 Email:wang_xiaojian@vip.163.com 通訊作者：樊曉寒

Email:ehan4348ff@gmail.com

R541

A

1000-3614（2015）02-0154-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.015