豬圓環(huán)病毒病的檢測評估及防控措施

柯 璐

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心福州350003；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室福州350003）

豬圓環(huán)病毒病的檢測評估及防控措施

柯 璐1,2

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心福州350003；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室福州350003）

以某豬場為調(diào)查對象，采取豬群血清，ELISA檢測結果顯示在被檢的27份血清中有33.3%為PCV抗體陽性，對該場進行臨床病癥調(diào)查，并采取可疑豬群病料通過PCR診斷，證實該場是否存在豬圓環(huán)病毒野毒感染，其結果為陽性，則制定緊急防控計劃，用PCV-2疫苗進行防控并追蹤調(diào)查檢測血清，該場的發(fā)病率明顯降低，PCV抗體檢測陽性率下降，且PCR診斷結果為陰性，表明了正確評估豬圓環(huán)病毒抗體檢測（ELISA）結果并結合PCR診斷對分析豬場PCV疫情有重要意義。

豬圓環(huán)病毒-2ELISAPCR防控

豬圓環(huán)病毒病是一系列慢性疾病的總稱，由圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）感染所致[1]。根據(jù)其致病性及基因組差異分為無致病性的豬圓環(huán)病毒1型（PCV-1）和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）[2]。PCV-2主要引發(fā)斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS）和豬皮炎與腎炎綜合征（PDNS）[3]。PCV-1對豬無致病性但能產(chǎn)生血清抗體，在豬群中普遍存在。因此，不能僅憑血清學檢測結果為抗體陽性即確診為該場PCV陽性，此外PCV病毒復制困難，同時易與一些病毒性和細菌性疾病混合或繼發(fā)感染，僅憑癥狀、病變及流行病學調(diào)查很難作出準確判斷[4-5]，建立聚合酶鏈式反應（PCR）方法，檢測PCV抗原對該病的診斷有重要意義。

對福建省某送檢豬場的血清樣品進行ELISA檢測，分析該場的PCV-2抗體陽性率，并在該場內(nèi)取可疑豬的病料進行PCR檢測，結合PCV-2抗體陽性率和PCR檢測結果分析評估該場的豬圓環(huán)病毒病疫情，并為該場制定緊急防控計劃，追蹤豬場疫情，從而建立有效的診斷和防控措施。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 血清學檢測材料、儀器與試劑病料：于福建省某一規(guī)模養(yǎng)豬場采集的27份血清樣本，于-20℃保存?zhèn)溆?。GF-M2000型酶標儀山東高密彩虹分析儀器有限公司；單道微量可調(diào)移液槍德國Eppendorf；37℃恒溫培養(yǎng)箱；PCV-2抗體檢測試劑盒，購自武漢科前動物生物制品有限責任公司。

1.1.2 PCR檢測材料、儀器與試劑病料：可疑豬的肺、淋巴結、腎等組織。PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；冷凍離心機；VXE380超低溫冰箱，德國JOUAN公司；GL212Pro全自動變焦凝膠成像系統(tǒng)，美國KODAK公司；Powerpac通用型電泳儀，美國BIO-RAD公司；SUBCELL-GT水平電泳槽系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司。試劑：蛋白酶K，20%SDS，無水乙醇，飽和酚，氯仿：異戊醇（24：1），乙酸鈉，異丙醇，75%乙醇，DEPC水，5×MMLV Buffer、MMLV(購于Promega公司)，Trizol LS Reagent、25 mg MgCl2、RNase inhibitor、dNTP mixture均購于大連寶生物工程公司。Taq酶；6×Loading Buffer，購自天根生化科技（北京）有限公司。參考GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的PCV-2基因序列，通過引物設計軟件Primer Premier 5.0和Oligo6.0引物分析軟件，設計PCV-2引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物：5′-ACATTTCCAGCAGTT-3′，下游引物：5′-CCTTATAATAATACA-3′。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測方法將檢測試劑盒于室溫放置1 h，將待檢血清用樣品稀釋液1∶40倍稀釋后加入微孔板中，100 μL/孔，同時將陰、陽性對照血清1∶4倍稀釋加入板中，100 μL/孔，各設2孔，另設一空白對照孔，加100 μL/孔稀釋液；輕輕振勻孔中樣品，置37℃溫育30 min。甩掉孔中溶液，用20倍稀釋的洗滌液洗板5次，每次200 μL/孔。洗滌時要將孔中液體倒空，并晾干。加入酶標二抗溶液（抗豬IgG 2HRP結合物），100 μL/孔。置37℃溫育30 min，洗板5次。每孔加入底物A液、B液各50 μL，混勻，室溫避光顯色10 min。每孔加入50 μL終止液終止反應，加入終止液的順序要與底物液一致。判定標準：豬圓環(huán)病毒抗體（PCV-2）：OD值＞0.42判為陽性，表明有抗體存在；0.38≤OD值≤0.42判為可疑，間隔一段時間后重新采樣檢測；OD值＜0.38時判為陰性，表明無抗體存在。

1.2.2 PCR檢測方法

1.2.2.1 臨床樣品與處理取可疑豬的肺、淋巴結、腎等組織，無菌采集組織病料，按1∶3加入TE Buffer研磨成組織懸液，-20℃反復凍融3次，1.2×104r/min離心10 min，取上清液備用。

1.2.2.2 DNA的抽提取研磨病料上清液300 μL，加入8 μL蛋白酶K和30 μL20%SDS，于37℃消化2 h，加入400 μL飽和酚，振蕩2 min，1.2×104r/min離心10 min；吸取上清400 μL，加入400 μL飽和酚，劇烈振蕩2 min，1.2×104r/min離心10 min；吸取上清200 μL，加入200 μL氯仿：異戊醇（24∶1），振蕩后1.2×104r/min離心10 min；吸取上清200 μL，加入20 μL乙酸鈉和550 μL無水乙醇，置液氮中1 min，1.2×104r/min離心10 min；棄上清，加入300 μL 75%乙醇洗滌，1.2×104r/min離心10 min；棄上清，于超凈臺中自然干燥，用TE溶解沉淀，-20℃保存。

1.2.2.3 PCR反應體系及條件PCR反應總體積20 μL：無菌水12.8 μL，10×PCR Buffer（含MgCl2）2.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA樣品模板2 μL。反應條件為：95℃5min，94℃1 min，53.5～56℃1 min，72℃1 min×35cycles，72℃10 min，4℃保存。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物電泳及特異性試驗取PCR反應產(chǎn)物6 μL，混合6×Loading Buffer 2 μL及EB染料2 μL，于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，80 V、50 min，在凝膠成像分析儀上觀察并拍照[6-9]。另取兩種常見的豬傳染病病毒（豬偽狂犬病病毒PRV和豬藍耳病病毒PRRSV）進行PCR特異性試驗。

2 結果與分析

2.1 血清學檢測結果檢測27份血清樣品，結果見表1。根據(jù)判定標準：OD值＞0.42為陽性，0.38≤OD值≤0.42為可疑，OD值＜0.38時判為陰性，對表1的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結果見表2。

表1 豬圓環(huán)病毒抗體檢測結果

表2 血清學檢測結果統(tǒng)計

由表2統(tǒng)計結果可知，該場的PCV抗體陽性檢測率為33.3%，可疑血清占11.1%。以血清標記為橫坐標，ELISA檢測OD值為縱坐標，繪制該場豬圓環(huán)病毒血清學檢測結果柱形圖，以判定值OD＝0.38為對比線，線下的樣品均為PCV抗體陰性?？芍庇^表示該場PCV ELISA抗體檢測的情況，見圖1。

2.2 豬群臨床癥狀調(diào)查觀察該場豬群的臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)被毛粗亂、體溫高達41.5℃、呼吸困難、皮下水腫的患豬，個別豬只出現(xiàn)漸進性消瘦或生長遲緩的癥狀，即為典型的PMWS癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)患豬的肝臟變硬，腎臟腫大。

2.3 PCR檢測結果取樣品的PCR產(chǎn)物3份，以及豬偽狂犬病病毒PRV和豬藍耳病病毒PRRSV的PCR產(chǎn)物各1份，以Marker-2 000 bp作為標準DNA分子量，在凝膠成像分析儀上觀察。

由圖2結果顯示，3份PCR產(chǎn)物電泳均擴增出約430 bp大小的PCV-2陽性條帶。而PRV和PRRSV的PCR產(chǎn)物未擴增出陽性片段。說明建立的PCR方法具有良好的特異性。該場PCV-2的血清學檢測與PCR檢測結果相符，且出現(xiàn)典型的臨床癥狀，確定該場暴發(fā)豬圓環(huán)病毒病。

2.4 防控試驗及疫情追蹤調(diào)查在確定該場暴發(fā)豬圓環(huán)病毒病后，為該場制定緊急防控計劃，用進口的勃林格PCV-2疫苗進行緊急防控。注射疫苗后該場豬圓環(huán)病毒病發(fā)病率明顯降低，發(fā)病豬只的臨床癥狀也減輕很多，防控試驗成功有效。結合豬場疫情，采集血清20份，ELISA抗體檢測陽性率為0%，可疑血清陽性率為5%。

圖1 血清學檢測結果OD值柱形圖

圖2 PCR電泳圖

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖

利用之前病料的PCR產(chǎn)物作為陽性對照，蒸餾水作為陰性對照，進行PCR診斷。結果顯示，注射疫苗后豬只組織PCR產(chǎn)物無任何陽性條帶。見圖3。

3 結論

通過PCV-2的血清學檢測發(fā)現(xiàn)，送檢規(guī)模豬場的PCV-2陽性率為33.3%，僅憑血清學檢測結果不能證實該場PCV-2感染，對該場豬群的臨床癥狀進行觀察，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)被毛粗亂、體溫高達41.5℃、呼吸困難、皮下水腫、肝臟變硬、腎臟腫大的患豬，懷疑該場內(nèi)暴發(fā)豬圓環(huán)病病。取患豬病料進行PCR檢測，檢測結果為陽性，即證實該場暴發(fā)豬圓環(huán)病毒病。該場使用進口的勃林格PCV-2疫苗進行防控后，豬圓環(huán)病毒病發(fā)病率明顯降低。PCV-2屬于DNA病毒，其核酸診斷的成本相對于RNA病毒低，同時因為ELISA檢測結果常出現(xiàn)假陽性，而通過建立PCR方法，可有效彌補ELISA檢測上的不足。

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Detection and control of porcine circovirus

Ke Lu1,2
(1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)uzhou 350003；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，F(xiàn)uzhou 350003)

A farm in fujian as the investigation object,take the herd of swine serum,ELISA test results show that serum were 33.3% positive in 27 sample,take the epidemic materials for PCR detection,the result is positive,Confirmed whether the presence of porcine circovirus virus infected,the result is positive,then develop a plan of prevention and control,with PCV-2 vaccine for prevention and control,and tracing investigation.After vaccination,the incidence of the organiser is decreased obviously.The positive rate of antibody detection,and the PCR diagnosis results were negative.Showed that the porcine circovirus virus antibody test(ELISA)combined with PCR detection methods to evaluate an outbreak of PCV has important significance.

PCV-2 ELISA PCR Control

A

1003-4331（2015）06-0001-03