避孕藥對不同糖質(zhì)量濃度下雌性黑腹果蠅壽命的影響

王彩艷，田禎祥，劉承宜

(1.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院和民族體質(zhì)與健康研究中心，激光運動醫(yī)學(xué)實驗室，廣州510006;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510006;3.棗莊學(xué)院體育學(xué)院，棗莊277000)

壽命是衡量衰老過程的最確切指標(biāo)，黑腹果蠅(Drosophlia melanogaster)壽命只有3個月左右，適合用于壽命研究.壽命實驗是通過統(tǒng)計生物的平均壽命(mean life span)和最高壽命(maximum life span)及其變化來衡量生命衰老規(guī)律和延緩衰老的方法［1］.Piazza 等［2］首次將黑腹果蠅引入運動生理學(xué)研究，證實了運動和飲食的抗衰老效應(yīng).低糖的膳食環(huán)境在女運動員中較多見，是引起女運動員三聯(lián)征的主要原因之一，避孕藥對運動成績的影響也存在爭議. 女運動員三聯(lián)征即飲食失調(diào)/不規(guī)律飲食習(xí)慣、閉經(jīng)/月經(jīng)過少、骨密度減低(骨質(zhì)疏松和骨量減少)，是女子運動中普遍存在的問題. Torstveit等［3］對精英運動員的調(diào)查顯示，優(yōu)秀運動員中有60.4%的人存在三聯(lián)征的風(fēng)險，而在有美學(xué)特性的表演類項目中這種比例高達(dá)66.4%，球類運動員的這種風(fēng)險為52.6%，一些體型偏瘦的運動項目中比例達(dá)到70.1%，這些運動員應(yīng)力性骨折的發(fā)生率較高.而對于模式生物黑腹果蠅來講，對其壽命影響因素的研究可間接反映運動員身體狀況的改變，從而影響運動成績的發(fā)揮［2］.本文用雌性黑腹果蠅作為研究模型，通過探究黑腹果蠅壽命的影響因素——白砂糖和避孕藥質(zhì)量濃度，為女運動員的健康維護提供研究線索.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型黑腹果蠅Oregon R 品系由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑養(yǎng)殖中心提供.

1.1.2 試劑與儀器 高活性酵母，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn);“佳一粒”精幼砂糖，廣東中輕糖業(yè)集團有限公司生產(chǎn);麥胚芽和酵母粉，安徽“燕之坊”食品有限公司生產(chǎn);“媽富隆”(去氧孕烯炔雌醇片)短效口服避孕藥，荷蘭歐加農(nóng)制藥公司;丙酸，天津大茂化學(xué)試劑廠;無水乙醇，天津大茂化學(xué)試劑廠;上皿電子天平，型號FA2004，上海天平儀器廠;Eppendorf 移液槍，Germany 制造.

1.1.3 實驗用培養(yǎng)基 培養(yǎng)基Ⅰ:為基本培養(yǎng)基，用于果蠅的傳代培養(yǎng)，其主要成分:水100 mL，白砂糖5 g，瓊脂1 g，玉米粉5 g，麥胚芽5 g，酵母粉4 g，丙酸0.5 mL.將除丙酸外的各成分混合，攪拌均勻，煮沸，快要冷卻時加丙酸攪拌均勻，分裝到已滅菌的培養(yǎng)管中.

培養(yǎng)基Ⅱ:探究不同糖質(zhì)量濃度對果蠅壽命的影響所用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比主要成分:水100 mL，瓊脂1.9 g，酵母粉3.2 g，丙酸0.87 mL，各組白砂糖質(zhì)量按表1 稱取，按培養(yǎng)基Ⅰ的方式煮培養(yǎng)基，其中4 號糖質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)培養(yǎng)基［4］.

培養(yǎng)基Ⅲ:探究不同避孕藥質(zhì)量濃度對果蠅壽命的影響所用的培養(yǎng)基，根據(jù)糖質(zhì)量濃度影響實驗的結(jié)果，按照表1 選擇1 號(低糖)、3 號(正糖)、14號(高糖)下生長的果蠅作為實驗動物.去氧孕烯炔雌醇片是一種短效口服避孕藥，可長期使用，其中每片含有去氧孕烯0.15 mg 與炔雌醇30 μg.按培養(yǎng)基Ⅰ的方式煮培養(yǎng)基Ⅱ中的1、3、14 號，冷卻加丙酸，攪拌均勻后按每100 mL 培養(yǎng)基加研磨充分的去氧孕烯炔雌醇片粉末分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 mg，攪拌均勻后分裝到不同管，編號依次為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，代表培養(yǎng)基Ⅲ的不同組.

表1 培養(yǎng)基中糖的質(zhì)量Table 1 The mass of sugar in culture medium g

1.2 實驗方法

1.2.1 果蠅培養(yǎng)條件 果蠅置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件:氣溫(25 ±1)℃，相對濕度45% ～75%，12 L:12 D 條件下培養(yǎng).所用培養(yǎng)管105 ×27 mm2，玻璃厚1.5 mm.

1.2.2 白砂糖對雌果蠅壽命影響 收集在培養(yǎng)基Ⅰ生長8 h 新羽化未交配的雌果蠅，隨機分管培養(yǎng)在培養(yǎng)基Ⅱ中，每組質(zhì)量濃度重復(fù)5 管，每管30 只雌果蠅.每5 天更換1 次培養(yǎng)基，每天統(tǒng)計果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡，計算平均壽命、平均最高壽命(后5 只死亡的平均時間)、半數(shù)死亡的時間、死亡曲線如圖1. 分析結(jié)果選擇1 號作為低糖組、3 號作為正常糖組、14 號作為高糖組進行下面的實驗.

1.2.3 去氧孕烯炔雌醇片對果蠅壽命影響 收集在培養(yǎng)基Ⅰ生長8 h 內(nèi)新羽化未交配的雌果蠅，隨機分管培養(yǎng)在培養(yǎng)基Ⅲ中，每質(zhì)量濃度組重復(fù)5 管，每管30 只雌果蠅. 每5 d 更換1 次培養(yǎng)基，每天統(tǒng)計果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡，計算平均壽命、平均最高壽命(后5 只死亡的平均時間)、半數(shù)死亡的時間、死亡曲線結(jié)果如圖2 ～5.

1.2. 4 統(tǒng)計方法 實驗3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析包處理，組間差異運用One-way ANOVA 方法進行分析，各組均數(shù)間差別比較采用LSD2 t檢驗，顯著水平為P ＜0.05;極顯著水平為P ＜0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖質(zhì)量濃度對雌果蠅壽命的影響

與0 組(無糖組)比較(圖1A)，糖質(zhì)量濃度1 ～8 組、10 組的平均壽命都有極顯著的延長，12 組有顯著的延長，其他高糖組(11 組、13 ～16 組)均無顯著性差異.平均最高壽命的結(jié)果顯示，與0 組相比，1 ～6 組都極顯著延長，14 ～16 組極顯著縮短. 半數(shù)死亡時間結(jié)果顯示，與0 組相比，除11 組無顯著性的差異、13 號顯著性延長外，其他各組都極顯著延長.如圖1B 所示，0 組果蠅的存活曲線位于坐標(biāo)軸最內(nèi)側(cè)，最高壽命為35 d;果蠅生長15 d，0、11 ～16組的果蠅存活率開始急劇下降，而1 ～7 組在25 d才開始大量死亡.

圖1 糖對雌果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 1 Effects of sugar on the longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

與3 號組(正糖)相比較，其他各組的雌果蠅平均壽命都有極顯著地縮短;各組的平均最高壽命(除1 號顯著降低外)均呈現(xiàn)極顯著降低;各組的半數(shù)死亡時間也都極顯著的降低(如圖1A).3 號組的存活曲線位于最外側(cè)，最高壽命是55 d 左右，較其他各組，3 號組的存活率狀態(tài)最好(如圖1B).

2.2 不同去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對雌果蠅壽命的影響

2.2.1 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對低糖模型的影響 在1 號組糖質(zhì)量濃度(低糖)下，與0 號組(無藥組)相比(圖2A)，1 ～8 號的平均壽命都顯著性延長，9 號和10 號差異不顯著. 各組平均最高壽命都與0 號組差異不顯著.1、5、6 號的半數(shù)死亡時間比0 號有顯著性延長，其他組與0 號均無顯著性差異. 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度并未對黑腹雌果蠅存活率產(chǎn)生顯著的影響(圖2B)，各質(zhì)量濃度組下的雌果蠅存活狀態(tài)變化不大，但去氧孕烯炔雌醇片能夠使雌果蠅的存活率略升高.

與5 號組相比，平均壽命除1 號和3 號無顯著性差異外，其他各組都顯著性縮短;與5 號給藥組的平均最高壽命相比，0、8、9、10 號組均有顯著性縮短;與5 號組的半數(shù)死亡時間相比，0、2、3、4 號有顯著性的縮短，8、9、10 號極顯著縮短(圖2A).

圖2 去氧孕烯炔雌醇片對低糖模型下果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 2 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the low sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

2.2.2 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對正常糖模型的影響 在3 號糖質(zhì)量濃度(正糖)模型下，1、4、5、7、9 號的平均壽命都比0 號組極顯著的延長(圖3A)，6、8 號有顯著性的延長;各組的平均最高壽命與0 號組相比都有極顯著的延長;與0 號組的半數(shù)死亡時間相比，1 號和10 號有極顯著性縮短，2 號顯著縮短，而5 號有極顯著的延長.由圖3B 可知，3、5號的存活曲線在外圍，1、2、10 號的存活曲線在內(nèi)側(cè)，存活時間較短.

與5 號相比，各組的平均壽命都極顯著縮短;8、9 號平均最高壽命與5 號比較無顯著性變化，2號顯著性延長，其他各組均極顯著縮短;其他各組的半數(shù)死亡時間均比5 號組有極顯著的縮短(如圖3A).

圖3 去氧孕烯炔雌醇片對正糖模型下果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 3 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the normal sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

2.2.3 去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對高糖模型的影響 如圖4A 顯示，14 號糖(高糖)模型下，去氧孕烯炔雌醇片與果蠅平均壽命的關(guān)系圖呈現(xiàn)不是很規(guī)則的變化.對于平均壽命，與0 號相比，2、8、10 均有極顯著差異，1、6、7 號均有顯著性差異.平均最高壽命顯示出與平均壽命相似的趨勢，與0 號相比，1、2、6、8、10 號有顯著性的縮短. 半數(shù)死亡時間顯示，與0 號組相比，2、8 號有極顯著性差異，1、10 號有顯著性差異.如圖4B 顯示，0、4、5 號的存活曲線在外圍，靠內(nèi)的則是2 號藥物質(zhì)量濃度.

與5 號組相比，2、8、10 號的平均壽命均極顯著縮短，4 號顯著上升;與5 號的平均最高壽命相比，1號和2 號有顯著性差異，8 號和10 號有極顯著性的縮短;只有2 號和8 號的半數(shù)死亡時間，與5 號組有極顯著性的差異(圖4A).

而與4 號組(本組壽命最高)相比，1、2、6、7、8、10 號的平均壽命都有極顯著性的降低，3、5 號有顯著性的降低;1、8、10 號的平均最高壽命則均有極顯著性降低，2、6 號則顯著性降低;2、8 號的半數(shù)死亡時間有極顯著性的縮短(如圖4A).

2.2.4 3個模型下，去氧孕烯炔雌醇片質(zhì)量濃度對果蠅最長壽命組影響的比較研究 如圖5A 顯示，與低糖(1 號糖模型下的5 號藥質(zhì)量濃度)比較，正糖(3 號糖模型下的5 號藥質(zhì)量濃度)的平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡時間都有顯著性的延長;高糖(14 號糖模型下的4 號藥質(zhì)量濃度)3個指標(biāo)都有極顯著的下降;正常無藥(3 號糖模型下的0 號藥質(zhì)量濃度)的平均壽命、半數(shù)死亡時間有顯著性的縮短，平均最高壽命有極顯著的縮短.圖5B 的存活率的結(jié)果顯示，與低糖模型的存活曲線相比，正常模型的存活曲線位于外圍，高糖模型的存活曲線位于內(nèi)側(cè)，正常無藥的存活曲線在35 天之前和低糖的很相似，但是35 天之后出現(xiàn)快速的縮短，最高壽命在40 天左右.

圖4 去氧孕烯炔雌醇片對高糖模型下果蠅壽命(A)及存活率(B)的影響Figure 4 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the high sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

與正常模型比較，低糖模型下的平均壽命、平均最高壽命、半數(shù)死亡時間都有顯著性的縮短(圖5A);高糖模型3個指標(biāo)都有極顯著的縮短;正常糖質(zhì)量濃度下的無藥組的半數(shù)死亡時間有顯著性的縮短，平均壽命、平均最高壽命都有極顯著的縮短. 圖5B 的存活率的結(jié)果顯示，與正常模型的存活曲線相比，低糖模型和正常無藥交織位于內(nèi)側(cè)，高糖的位于最內(nèi)側(cè)，揭示存活率較低. 與高糖模型比較，正常無藥的各指標(biāo)都有極顯著的延長. 圖9B 的存活率的結(jié)果顯示，與高糖模型比較，正常無藥的存活曲線位于外側(cè)(圖5A).

3 討論

動物的生長發(fā)育離不開攝食，Jiang 等［5］在酵母、Lakowski 等［6］在線蟲、Chapman 等［7］在果蠅、Weindruchb 等［8］在嚙齒動物乃至人類中已經(jīng)證實減少營養(yǎng)的攝入可以延長壽命［9］. 果蠅生活在培養(yǎng)管中，能量的來源只有培養(yǎng)基，因此研究培養(yǎng)各成分對果蠅壽命的影響對飲食限制具有實際意義. 糖是各種果蠅培養(yǎng)基不變的成分，研究發(fā)現(xiàn)果蠅能量限制的倒“U”型曲線［10］，這種曲線會隨著果蠅品系、食物來源、雌雄的差異等因素的變化而不同，本研究細(xì)化了糖質(zhì)量濃度，拉大了糖質(zhì)量濃度的范圍，發(fā)現(xiàn)在40.5 mg/mL 糖濃度(3 號組)下雌性黑腹果蠅的壽命顯著延長，與3 號糖組相比，無糖(0 號)組和高糖組(11 ～16 號)壽命顯著降低，沒有能量與能量過剩都會導(dǎo)致壽命的縮短.1 號屬于低糖狀態(tài)，低糖狀態(tài)的雌性黑腹果蠅雖然沒有3 號正常糖下的黑腹果蠅壽命長，但相對于高糖和無糖狀態(tài)的黑腹果蠅壽命是顯著性的延長，這就提示適度降低糖元素的攝入對壽命的影響是有益的，同樣對于運動員也是成立的.但是長期低糖膳食是引發(fā)女運動員三聯(lián)征的原因之一. 因此本文通過研究膳食和避孕藥兩者因素作用對雌性黑腹果蠅壽命的影響，使果蠅壽命狀態(tài)最佳，為解決女運動員三聯(lián)征問題提供線索.

圖5 去氧孕烯炔雌醇片對3 種條件下最長壽命組果蠅壽命(A)及存活率(B)影響Figure 5 The effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the longevity (A)and the survival rate (B)of three kinds of female D. melanogaster

當(dāng)女性激素增多時，就會通過丘腦下部抑制或減少腦垂體分泌促性腺激素. 一旦促性腺激素被抑制或減少，卵巢里的卵泡就不會發(fā)育成熟和排卵.去氧孕烯炔雌醇片是一類短效口服避孕藥，通過去氧孕烯與炔雌醇抑制垂體－性腺軸來抑制排卵，另外還能增加宮頸粘液的粘稠度，達(dá)到避孕的效果.范光升等研究短效口服避孕藥是女性常用避孕藥，使生理周期達(dá)到一個新的周期，是有效而可逆的避孕方法之一［11］.避孕藥中含有雌激素，女性隨著年齡的增長體內(nèi)雌激素水平會顯著下降，長期服用避孕藥能起到調(diào)節(jié)體內(nèi)激素平衡的作用，對改善痛經(jīng)、痤瘡，光滑皮膚有幫助［12］. Philip C Hannaford 調(diào)查超過46 000 名英國女性分析了口服避孕藥使用情況與病死和暴力傷害致死之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人生某些階段曾服用避孕藥的女性，因疾病死亡的風(fēng)險較低［13］.但近幾年關(guān)于長期口服避孕藥危害的研究也在同樣受到關(guān)注，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對糖脂代謝及血液學(xué)確實存在影響，但對免疫系統(tǒng)和遺傳基因影響不大，未有充分證據(jù)說明對腫瘤發(fā)生的促進作用［14］.我們的研究發(fā)現(xiàn)在低糖模型下(13.5 mg/mL)，0.25 mg/mL 的避孕藥可以顯著地延長果蠅壽命，而無避孕藥和高避孕藥質(zhì)量濃度都不利于雌性黑腹果蠅的生長;正常糖模型下(40.5 mg/mL)，避孕藥也是在0.25 mg/mL 質(zhì)量濃度下的雌性果蠅壽命狀況最好，顯著性相比低糖狀態(tài)更為明顯;然而在高糖模型下，雌性果蠅的壽命隨避孕藥質(zhì)量濃度變化不再出現(xiàn)明顯的倒U 型曲線，壽命最高點的質(zhì)量濃度出現(xiàn)在4號(0.20 mg/mL)，無避孕藥組的壽命較高，高質(zhì)量濃度組也未出現(xiàn)顯著性的下降. 提示運動員在服用避孕藥或激素類藥物的同時要注意飲食習(xí)慣的影響，低糖或者正常糖攝入會使避孕藥的作用發(fā)生顯著的變化.

4 結(jié)論

(1)在糖質(zhì)量濃度(40.5 mg/mL)(3 號組)下雌性黑腹果蠅的壽命顯著延長，與3 號糖組(正糖)相比，無糖(0 號)組和高糖組(11 ～16 號)壽命顯著降低，沒有能量與能量過剩都會導(dǎo)致壽命的縮短.

(2)由不同糖模型狀態(tài)下避孕藥對雌性黑腹果蠅壽命影響的結(jié)果提示運動員在服用避孕藥或激素類藥物的同時要注意飲食習(xí)慣的影響，低糖或者正常糖攝入會使避孕藥的作用發(fā)生顯著的變化.

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