1α,25(OH)2D3調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解的實驗研究*

李思維 牛國棟 劉忠軍 宋純理 張克冷慧杰

（北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京100191）

·基礎(chǔ)研究·

1α,25(OH)2D3調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解的實驗研究*

李思維 牛國棟 劉忠軍 宋純理 張克**冷慧杰**

（北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京100191）

背景：維生素D代謝水平與關(guān)節(jié)炎的關(guān)系仍存在爭議，且維生素D對關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原代謝的調(diào)控機制尚不明晰。深入了解維生素D對骨關(guān)節(jié)炎軟骨代謝的作用，有助于了解骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制，為預(yù)防、治療骨關(guān)節(jié)炎提供參考。

目的：在細胞水平和組織塊水平，探討維生素D對關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原代謝的調(diào)控作用。

方法：使用炎癥因子OSM和TNF-α誘導(dǎo)軟骨Ⅱ型膠原降解，對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞以及牛關(guān)節(jié)軟骨組織塊分別進行1α, 25(OH)2D3干預(yù)，通過ELISA檢測細胞上清中Ⅱ型膠原羧基末端肽（CTX-Ⅱ）水平，從而評估維生素D對軟骨Ⅱ型膠原代謝的調(diào)控作用。

結(jié)果：1α,25(OH)2D3可以提高未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的以及OSM和TNF-α誘導(dǎo)后的軟骨細胞的活性。在細胞水平，1α,25(OH)2D3對正常細胞上清中的CTX-Ⅱ的水平?jīng)]有顯著影響。OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著增加了細胞上清中CTX-Ⅱ的水平。1α,25(OH)2D干預(yù)降低了OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞上清中CTX-Ⅱ的水平。在組織塊水平，對于正常軟骨組織塊，1α,25(OH)2D3增加了CTX-Ⅱ水平。OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著增加了體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨組織塊軟骨的降解，細胞上清中CTX-Ⅱ水平顯著增高。對于OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨組織塊，1α,25(OH)2D3干預(yù)降低了軟骨組織塊Ⅱ膠原的降解，CTX-Ⅱ水平顯著降低。

結(jié)論：1α,25(OH)2D3能夠抑制OSM和TNF-α誘導(dǎo)的Ⅱ型膠原降解作用。維生素D可能通過抑制關(guān)節(jié)炎軟骨的降解起到保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。

維生素D；關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；軟骨組織塊培養(yǎng)；Ⅱ型膠原羧基末端肽

Background:ound:Disagreementon the relationship between vitam in Dmetabolism and osteoarthritis(OA)stillexists in the literatures.Investigating the role of vitam in D in OA cartilagemetabolism w ill help to well understand the etiology and pathogenesisof OA,andw ill contribute to improvement in the prevention and treatmentof OA.

Objective:tive:To investigate themodulation of vitamin D on collagen typeⅡdegradation atcelland tissue levels.

Methods:hods:Rat articular chondrocytes and bovine articular cartilage explantsw ere stimulated by inflammatory factors(OSM and TNF-α)to imitateOA cartilage chondrocytes,thenwere treated by 1α,25(OH)2D3.C term inal fragmentsof typeⅡcollagen(CTX-Ⅱ)expression in supernatantwasmeasured by ELISA to evaluate degradation of collagenⅡ.

Results:ults:At cellular level,the combined effects of OSM and TNF-αincreased CTX-Ⅱ level in supernatant.1α,25(OH)2D3decreased theCTX-Ⅱ levelw hich was induced by OSM plus TNF-α.A t the tissue level,the stimulation of OSM plus TNF-α increased CTX-Ⅱ level in the supernatant.1α,25(OH)2D3increased the CTX-Ⅱ levels in the normal cartilage tissue.1α,25 (OH)2D3decreased CTX-Ⅱlevels in cartilage tissuew ith OSM plus TNF-αstimulation.

Conclusions:ions:1α,25(OH)2D3can inhibit the degradation of collagenⅡin articular chondrocytes stimulated by OSM plus TNF-α.Vitamin Dmay play a protective role in articular cartilage through regulation of cartilage turnover.

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。以關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原纖維降解、蛋白多糖進行性耗損為主要特征。關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原纖維降解主要是由于軟骨組織分解代謝和合成代謝的紊亂，打破了軟骨組織的代謝穩(wěn)態(tài)。這種持續(xù)的異常的軟骨組織代謝紊亂導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨分解代謝增加和

關(guān)節(jié)炎病理過程的激活，最終形成不可逆的關(guān)節(jié)軟骨破壞和功能障礙[1-3]。

維生素D是一種脂溶性維生素，具有重要的生理作用。研究表明，維生素D缺乏時可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、佝僂病、軟骨病、糖尿病、心血管疾病、多發(fā)硬化、風濕性關(guān)節(jié)炎，甚至結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等[4-8]。維生素D缺乏（血清25-(OH)D3＜37.5 nmol/L）是一種常見的全球性疾患，尤其是在北半球的國家和地區(qū)[9]。多項臨床大樣本的流行病研究顯示，低水平血清維生素D3與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進展密切相關(guān)[10-12]，但有部分流行病學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)維生素D3水平與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生無相關(guān)性[13,14]。導(dǎo)致這種爭議的原因可能在于實驗設(shè)計、環(huán)境、飲食、生活習慣、種族等多種因素的影響。越來越多的實驗證據(jù)支持維生素D對關(guān)節(jié)軟骨具有積極的保護作用。有實驗表明維生素受體表達于人關(guān)節(jié)軟骨細胞，這說明關(guān)節(jié)軟骨是維生素D的靶組織[15]。動物實驗研究表明25-羥維生素D 1α羥化酶（25-hydroxyvitam in D 1α-hydroxylase）基因敲除直接導(dǎo)致了小鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎的進展[16]。在維生素D缺乏的情況下，補充維生素D可顯著降低生長板軟骨膠原酶的活動[17]。而膠原酶是導(dǎo)致軟骨細胞外基質(zhì)降解的重要酶類。維生素D補充也可改善膠原誘導(dǎo)和交叉韌帶離所斷誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎[18,19]。

目前，維生素D對于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和發(fā)展作用的機理尚不清楚。本研究通過細胞培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)，旨在從多個層面探索維生素D在關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解中的調(diào)控作用，進一步理解維生素D保護關(guān)節(jié)的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要試劑儀器

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞來自新生Sprague-Daw ley大鼠，新鮮牛關(guān)節(jié)軟骨來自北京屠宰場。本研究得到北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準。主要實驗試劑及儀器如下：1α,25(OH)2D3（Selleck，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國）；CCK 8試劑盒（Dojindo，日本）；CTX-Ⅱ ELISA試劑盒（HCB，加拿大）；0.25%胰蛋白酶，低糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗（Corning，美國）；制瘤素M（OSM）（Sino Biological，中國）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（PEPROTRCH，美國）。

1.2 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞分離與培養(yǎng)

將5只出生24 h內(nèi)的Sprague-Daw ley大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5m in后取出。用眼科剪和眼科鑷分離膝關(guān)節(jié)的透明軟骨，放入盛有含有雙抗的PBS培養(yǎng)皿中。剔除殘余的軟組織，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，PBS洗4次，每次2m in，棄上清。洗凈的軟骨塊移入6孔板中，用眼科剪將軟骨塊剪碎，加入約2m l的Ⅱ型膠原酶。用吸管充分吹打混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育2 h，每隔30m in用塑料吸管吹打一次并收取細胞。加入10%FBS完全培養(yǎng)液終止消化，充分吹打混勻后收集至15m l的離心管中，以800 g/m in的速度，離心5m in，棄上清。加入5m l完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻，終止消化，取混懸液分至2個中皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此后隔日換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞生長面積達到培養(yǎng)皿底部的80%時進行細胞傳代[20]。

1.3 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞鑒定

1.3.1 甲苯胺藍染色：取出細胞爬片，PBS洗2次，每次5m in。4%多聚甲醛室溫下固定1 h，再以PBS洗2次，每次5m in。加入1%甲苯胺藍染液，37℃孵育2 h。去除多余的染液，PBS洗2次，每次5m in。最后脫水透明，封片。

1.3.2 Ⅱ型膠原免疫熒光染色：取出細胞爬片，PBS洗2次，每次5m in。4%多聚甲醛固定10m in，PBS洗2次，每次5m in。PBST（PBS加0.1%TritonX100）通透20～30m in，5%BSA室溫封閉1 h。加入Ⅱ型膠原抗體（稀釋度為1∶200），4℃孵育過夜。PBS洗3次，每次5m in，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗兔二抗（稀釋度為1∶200），室溫避光孵育1 h。PBST洗3次，每次5m in，加入10μg/LDAPI室溫避光孵育5m in。熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.4 CCK CCK88法檢測11α,,2525(OH)(OH)22D D33對關(guān)節(jié)軟骨細胞活性的作用

在96孔板上，每孔種植2.5×104個軟骨細胞；過夜，使細胞得以黏附、延伸，具體分組及干預(yù)方式如下:①對照組，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；②無誘導(dǎo)低劑量組，10 nmol/L 1α,25(OH)2D3；③無誘導(dǎo)高劑量組，100nmol/L 1α,25(OH)2D3；④誘導(dǎo)組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m l OSM，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑤誘導(dǎo)后低劑量組，20ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，10 nmol/L 1α, 25(OH)2D3；⑥誘導(dǎo)后高劑量組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m l OSM，100 nmol/L 1α,25(OH)2D3。每組6個復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育，倒置顯微鏡下觀察。24 h后每孔內(nèi)加入CCK-8溶液20μl，繼續(xù)孵育3 h，終止培養(yǎng)。檢測以上不同濃度的1α,25(OH)2D3作用后各組軟骨細胞在490 nm波長處的吸光度值（OD值）。

1.5 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原的降解作用

在24孔板上，每孔種植5×104個軟骨細胞，過夜，使細胞貼壁增殖，具體干預(yù)方式如下：①對照組，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；②無誘導(dǎo)低劑量組，10nmol/L 1α,25(OH)2D3；③無誘導(dǎo)高劑量組，100 nmol/L 1α,25 (OH)2D3；④誘導(dǎo)組，10 ng/m l TNF-α，5 ng/m l OSM，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑤誘導(dǎo)后低劑量組，10 ng/m l TNF-α，5ng/m lOSM，10nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑥誘導(dǎo)后高劑量組，10ng/m l TNF-α，5 ng/m lOSM，100nmol/L 1α,25(OH)2D3。每組3個復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育。24h后收取細胞上清。檢測以上不同濃度的1α,25(OH)2D3作用24 h后各組軟骨細胞培養(yǎng)上清中CTX-Ⅱ的濃度。

1.6 11,,2525(OH)(OH)22D D33對體外關(guān)節(jié)軟骨組織塊的降解作用

新鮮完整牛膝關(guān)節(jié)軟骨無菌條件下取材，每組10個軟骨塊，重量為（14±2）mg。放入含有雙抗的PBS中反復(fù)漂洗3次。然后置于96孔板中，每孔加入200μl低糖-DMEM培養(yǎng)基，具體干預(yù)方式及分組如下：①對照組，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；②無誘導(dǎo)低劑量組，10 nmol/L 1α,25(OH)2D3；③無誘導(dǎo)中劑量組，100 nmol/L 1α,25(OH)2D3；④無誘導(dǎo)高劑量組，1000 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑤ 誘導(dǎo)組，20 ng/m l TNF-α，10ng/m lOSM，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑥誘導(dǎo)后低劑量組，20ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，10nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑦誘導(dǎo)后中劑量組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，100 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑧誘導(dǎo)后高劑量組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，1000 nmol/L 1α,25(OH)2D3。組織塊在以上無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，每7 d更換培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)液-80°C凍存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各實驗條件下從組織塊釋放的CTX-Ⅱ的水平。本法靈敏度為1 pg/m l。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用One-way Anova檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨細胞鑒定

細胞在光鏡下呈梭形或者三角形，鏡下呈鋪路石樣表現(xiàn)（圖1A）。甲苯胺藍染色細胞后呈藍色，提示該細胞表達蛋白聚糖（圖1B）。細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示所有細胞表達Ⅱ型膠原（圖1C），可以確認該細胞為軟骨細胞。

2.2 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對關(guān)節(jié)軟骨細胞活性的調(diào)節(jié)作用

與非OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞（對照組）相比，OSM和TNF-α誘導(dǎo)后的軟骨細胞（誘導(dǎo)組）活性有所下降，但兩組之間并無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖2A）。1α,25(OH)2D3干預(yù)對非OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞活性具有一定的促進作用，但沒有劑量依賴性（圖2B）。對于OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞，10 nmol/L（誘導(dǎo)后低劑量組）和100 nmol/L（誘導(dǎo)后高劑量組）的1α,25(OH)2D3均可提高軟骨細胞的活性（圖2C）。

2.3 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原的代謝作用

與對照組相比，OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著增加了軟骨細胞細胞Ⅱ型膠原的降解。細胞上清中CTX-Ⅱ水平顯著增高（P＜0.05，圖3A）。在未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細胞中，不同劑量1α,25(OH)2D3并未增加其CTX-Ⅱ水平（圖3B）。然而在OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞，10 nmol/L和100 nmol/L的1α, 25(OH)2D3均降低了軟骨細胞Ⅱ型膠原的降解（圖3C）。

2.4 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨組織塊的降解作用

圖1 光鏡下及染色后的細胞形態(tài)觀察

圖2 軟骨細胞活性檢測

與對照組比較，OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著促進了體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨組織塊的降解，細胞上清中CTX-Ⅱ水平顯著增高（P＜0.05，圖4A）。對于未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細胞，無誘導(dǎo)低劑量組1α, 25(OH)2D3干預(yù)對細胞上清中CTX-Ⅱ水平?jīng)]有顯著影響。中劑量組和高劑量組1α,25(OH)2D3干預(yù)顯著增加了細胞上清中CTX-Ⅱ水平（圖4B）。對于OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細胞，10、100、1000 nmol/L的1α,25(OH)2D3均降低了軟骨細胞Ⅱ型膠原的降解，CTX-Ⅱ水平顯著降低（圖4C）。

3 討論

本研究探討了維生素D在關(guān)節(jié)炎軟骨代謝中可能發(fā)揮的作用。實驗結(jié)果顯示無論在炎癥因子刺激的軟骨細胞，還是未經(jīng)刺激的正常軟骨細胞中，維生素D均能改善軟骨細胞的活性，這提示維生素D能夠促進軟骨細胞的生長和增殖。實驗中使用的OSM和TNF-α是兩種在關(guān)節(jié)炎發(fā)生和進展中起著重要作用的細胞因子，二者聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著促進軟骨組織的分解代謝[21,22]。本實驗通過細胞因子OSM和TNF-α處理關(guān)節(jié)軟骨，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨降解。CTX-Ⅱ是軟骨組織Ⅱ型膠原降解的產(chǎn)物，能夠有效地反應(yīng)關(guān)節(jié)炎軟骨的狀況[23,24]，我們使用1α,25(OH)2D3干預(yù)軟骨細胞并通過檢測CTX-Ⅱ評估軟骨降解情況。

細胞培養(yǎng)研究和軟骨組織塊培養(yǎng)研究均顯示OSM和TNF-α可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨CTX-Ⅱ的水平顯著上升，提示炎癥性的細胞因子能夠增加關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原的降解作用；并且1α,25(OH)2D3干預(yù)可以顯著抑制OSM和TNF-α所導(dǎo)致的CTX-Ⅱ水平上升。這說明1α,25(OH)2D3能夠抑制關(guān)節(jié)炎性的軟骨細胞高分解代謝狀況，緩解關(guān)節(jié)炎軟骨細胞外基質(zhì)的降解。有意思的是，對于未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細胞，1α,25(OH)2D3的干預(yù)可以使細胞上清中CTX-Ⅱ水平升高。這說明軟骨細胞對維生素D的反應(yīng)性因自身狀態(tài)的改變而改變，關(guān)節(jié)炎軟骨細胞和正常軟骨細胞可能對維生素D的反應(yīng)并不一致。這種現(xiàn)象可能提示，正常生理狀態(tài)下1α,25(OH)2D3可以少量增加軟骨細胞Ⅱ型膠原的降解，其機制不

明，可能這種作用尚處于軟骨基質(zhì)正常的降解、重建、修復(fù)的穩(wěn)態(tài)之中，不足以減少關(guān)節(jié)軟骨量，以致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進展。

圖3 軟骨細胞上清CTX-Ⅱ檢測

圖4 組織塊釋放的CTX-Ⅱ的檢測

本研究顯示關(guān)節(jié)軟骨組織塊對1α,25(OH)2D3的反應(yīng)性與大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基本相似，二者可以相互驗證。利用關(guān)節(jié)軟骨組織塊研究維生素D對關(guān)節(jié)軟骨作用的研究還未見報道。關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)，對于評價維生素D對軟骨組織的作用有其獨特優(yōu)勢。一方面，關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)可以排除其他因素的影響，如軟骨下骨和滑膜的影響。維生素D是骨質(zhì)疏松治療的藥物之一，它對軟骨下骨的骨質(zhì)量也有顯著影響。軟骨下骨的力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)的改變在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和進展中具有重要作用。在需要排除關(guān)節(jié)下骨影響的研究中，關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)是較好的選擇。另一方面，關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)可以有效地保留了細胞外基質(zhì)。軟骨組織具有細胞數(shù)目少，細胞外基質(zhì)成分多的特點。在骨關(guān)節(jié)炎病理過程中，軟骨組織細胞外基質(zhì)降解是關(guān)節(jié)炎的重要病理特征之一，細胞外基質(zhì)有其重要生理作用。軟骨組織塊培養(yǎng)是一種探討藥物對軟骨直接作用的良好工具。因此我們選用細胞體外培養(yǎng)和組織塊體外培養(yǎng)的方法探討維生素D對軟骨代謝的直接作用。

目前對骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制仍缺乏足夠的了解，尚未形成一種特效的治療方法。由于骨關(guān)節(jié)炎病程長，需要長期使用病情改善性藥物，因此對藥物的安全性要求很高。理想的骨關(guān)節(jié)炎藥物應(yīng)該具有以下特征：經(jīng)濟安全，依從性好，能夠改善關(guān)節(jié)炎病情。維生素D容易獲得，經(jīng)濟，安全性好，患者依從性良好，能夠改善軟骨下骨的骨質(zhì)疏松，同時具有直接調(diào)控軟骨代謝的作用。因此，維生素D是具有很大的潛力及良好應(yīng)用前景的關(guān)節(jié)炎治療藥物。

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11α,,2525(OH)(OH)22D D33 regulatesdegradation of type f typeⅡcollagen in articular cartilage*

LISiwei,NIUGuodong,LIU Zhongjun,SONGChunli,ZHANG Ke**,LENGHuijie**
(Departmentof Orthopedics,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China)

ords:Vitamin D;Osteoarthritis;Chondrocytes;Cartilageexplants culture;C-telopeptide fragmentsof typeⅡcollagen

2095-9958（2015）04-0 161-06

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.02-014

國家自然科學(xué)基金（項目編號：11472017，1002004）

**通信作者：冷慧杰，Email：lenghj@bjmu.edu.cn；張克，Email：zhangke60@medmail.com.cn