骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷移植途徑的實(shí)驗(yàn)

趙學(xué)正唐開(kāi)

（1.杭州市西溪醫(yī)院骨科，杭州310023；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧大連116011）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷移植途徑的實(shí)驗(yàn)

趙學(xué)正1唐開(kāi)2*

（1.杭州市西溪醫(yī)院骨科，杭州310023；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧大連116011）

背景：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植治療脊髓損傷（SCI）成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，采用何種移植途徑更有利于BMSCs在脊髓損傷處存活、分化，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，更適合于臨床應(yīng)用，是當(dāng)前亟待解決的主要問(wèn)題。

目的：BMSCs通過(guò)直接注射、股靜脈注射和腰椎穿刺三種途徑移植到脊髓損傷大鼠模型內(nèi)，觀察、比較并篩選適于臨床應(yīng)用的移植途徑。

方法：采用全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs。采用改良A llen's法建立T10脊髓損傷大鼠模型，建模后3 d隨機(jī)分為模型對(duì)照組（A組）、直接注射組（B組）、股靜脈注射組（C組）、腰椎穿刺組（D組）。BMSCs移植后3、7、14、21 d采用BBB評(píng)分方法對(duì)各組大鼠評(píng)分。免疫組化檢測(cè)各組5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）單染的Brdu+細(xì)胞、Brdu+膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和Brdu+神經(jīng)微絲蛋白200（NF-200）雙陽(yáng)性細(xì)胞，并計(jì)算各組GFAP、NF-200表達(dá)的平均光密度值（MOD）。

結(jié)果：BMSCs遷移至脊髓損傷部位并存活，還可表達(dá)GFAP和NF-200。移植后各組GFAP和NF-200的MOD均增加，B、C、D組大鼠功能恢復(fù)明顯。

結(jié)論：綜合評(píng)判和比較三種移植途徑，腰椎穿刺是一種侵襲性較小、較為理想的細(xì)胞植入方式，相對(duì)優(yōu)于直接注射和股靜脈注射，更適于臨床應(yīng)用。

間質(zhì)干細(xì)胞移植；脊髓損傷

Background:ound:The transp lantation of bonemarrow stromal cells(BMSCs)for the treatmentof spinal cord injury(SCI)hasbecome a focus athome and abroad.It is essential to choose a suitable grafting pathway by whichmore simple operation and higher survival rate can beachieved.

Objective:tive:To transplantBMSCs in SCI ratsby direct injection,lumbar puncture,femoralvenousdelivery and selecta proper pathway for clinicalapplication.

Methods:hods:BMSCs were isolated by w holemarrow method.SCI ratmodels w ere established by modified A llen's Weight Drop.Aftermodeling,the ratswere random ly assigned into 4 groups:control group,direct injection group,femoral venous delivery group,and lumbar puncture group.Locomotor function was assessed by BBB score 3 d,7 d,14 d,and 21 d after BMSC transplantation.Simple-staining 5-bromo-2-deoxyuridine(Brdu),double-staining Brdu+glial fibrillary acidic protein(GFAP)and Brdu+neuro filaments-200(NF-200)were identified by immunohistochemistry.Mean optical density (MOD)of NF-200 and GFAPwere calculated.

Results:ults:BMSCswere successfully transplanted in the injured spinal cord.GFAPand NF-200 protein were expressed in implanted BMSCs.MOD of GFAPand NF-200 increased in all rats after transplantation.Locomotor function of direct injection group,femoralvenousdelivery group,and lumbar puncturegroup improved significantly.

Conclusions:ions:Lumbar puncture is less invasiveand superior to direct injection and femoralvenous delivery in BMSCs transplantation pathways for treatmentof SCI.

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）常導(dǎo)致患者損傷平面以下感覺(jué)缺失和運(yùn)動(dòng)功能障礙，使患者的生活質(zhì)量大大降低，但SCI的有效治療仍是一個(gè)難以解決的問(wèn)題。隨著神經(jīng)生物學(xué)和組織工程學(xué)的快速發(fā)展，各種創(chuàng)新技術(shù)不斷應(yīng)用于SCI的治療。目前從研

究SCI修復(fù)機(jī)制的角度來(lái)看，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow stromal cells,BMSCs）[1]移植治療SCI是一種更有前景的治療方法[2,3]。BMSCs既可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，本身又能分泌或者刺激機(jī)體產(chǎn)生一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子來(lái)參與脊髓功能和組織的修復(fù)[1]。

目前BMSCs治療SCI較常用的方法是將細(xì)胞直接注射到損傷局部[4-6]，這種方法毫無(wú)置疑能提高細(xì)胞在損傷區(qū)域的存活數(shù)量，然而當(dāng)出現(xiàn)廣泛區(qū)域損傷或多發(fā)病灶等問(wèn)題時(shí)，臨床實(shí)際操作比較困難；而且該方法屬于有創(chuàng)操作，需要手術(shù)暴露損傷的脊髓組織，將對(duì)脊髓或周圍組織造成二次損傷，使損傷局部的微環(huán)境更不利于移植細(xì)胞的存活，從而降低療效。采用何種移植途徑能更有效地增加BMSCs在脊髓損傷處的存活數(shù)目，更適合臨床應(yīng)用，是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。要讓BMSCs移植治療SCI廣泛、高效地應(yīng)用于臨床，就需要有一種安全有效、易于操作、創(chuàng)傷小，且讓患者在生理和心理上比較容易接受的方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腰椎穿刺的方法使BMSCs隨腦脊液到達(dá)脊髓損傷區(qū)域，另以股靜脈注射和損傷局部直接注射的方法作為對(duì)比，比較三種途徑植入的BMSCs向脊髓損傷處遷移和存活的情況，以找到更適用于臨床應(yīng)用的細(xì)胞植入途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6周齡健康級(jí)SD大鼠4只，雌雄不限，體質(zhì)量120～140 g（用于提取BMSCs做原代培養(yǎng)）；選取成年健康級(jí)SD大鼠48只，雌性，220～250 g（用于制作SCI模型），均購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)SPF中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的有關(guān)規(guī)定[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定：引頸處死SD大鼠后75%乙醇浸泡約15m in，無(wú)菌條件下迅速取出雙側(cè)股骨和脛骨。然后剪斷股骨和脛骨干骺端暴露骨髓腔，用7號(hào)注射針頭吸取L-DMEM 5m l反復(fù)沖洗骨髓腔3～4次至骨質(zhì)呈白色。收集沖洗液置入15m l離心管中，再輕輕吹打數(shù)次，室溫下離心5 m in（1500 rpm）后棄去上清液，加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打重懸制成細(xì)胞懸液。置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。72 h后觀察細(xì)胞的貼壁情況，并更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d換液1次，待貼壁細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化至細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形，終止消化后按1:2比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)，采用及時(shí)反復(fù)傳代的方法對(duì)BMSCs進(jìn)行擴(kuò)增和純化。

取第5代BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物CD29、CD90和CD45、CD11b/c，上述操作由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.2 SD大鼠SCI模型的建立：健康級(jí)SD大鼠48只，雌性。稱重后給予10%水合氯醛0.3m l/100 g腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥于手術(shù)臺(tái)上。以T10棘突為中心常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，做長(zhǎng)約2 cm的縱行切口，逐層剪開(kāi)皮膚、筋膜、鈍性分離椎旁軟組織，暴露T9～T11棘突和椎板并游離T10椎板上下緣，咬去T9、T11的部分椎板和T10的全部椎板，充分暴露T10節(jié)段脊髓。用改良Allen's打擊器，2 g重的不銹鋼桿自三維立體定向儀上自由落下12.5 cm（打擊勢(shì)能為25 g·cm），造成T10脊髓挫裂傷，損傷面直徑為2mm，以大鼠尾部痙攣性擺動(dòng)和雙后肢軀體回縮樣撲動(dòng)為打擊成功標(biāo)志。甲硝唑和生理鹽水反復(fù)沖洗切口，無(wú)菌明膠海綿覆蓋于暴露的硬脊膜，逐層縫合肌肉和皮膚，用0.02%碘伏消毒皮膚切口。SCI大鼠模型制作成功后前3 d，每日2次慶大霉素腹腔注射預(yù)防感染。防止發(fā)生尿潴留，每日3次對(duì)大鼠膀胱按摩排尿直到自主排尿功能恢復(fù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和BMSCs移植：SCI造模成功后3 d將大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只。A組為模型對(duì)照組；B組為直接注射組；C組為股靜脈注射組；D組為腰椎穿刺組。分別于移植后3、7、14、21 d處死大鼠。在移植前48 h取第5代的BMSCs，在細(xì)胞融合至30%～40%時(shí)將5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu）工作液（500μmol/L）加入BMSCs培養(yǎng)皿中，使Brdu終濃度為10μmol/L，在37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育。48 h后消化收集，用0.01mol/L PBS洗滌兩次，置于冰浴中1 h內(nèi)進(jìn)行移植。A組不進(jìn)行細(xì)胞移植，B組在損傷區(qū)頭尾兩端共注射1.5×105個(gè)BMSCs，C組通過(guò)股靜脈注射1m l細(xì)胞懸液約1×106個(gè)BMSCs，D組通過(guò)腰椎穿刺注射100μl細(xì)胞懸液約1×106個(gè)BMSCs。

1.2.4 神經(jīng)功能障礙BBB評(píng)分[8]：根據(jù)BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分采用雙人、雙盲法獨(dú)立觀察大鼠雙后肢的運(yùn)動(dòng)功能并記錄，對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估。分別于損傷

前、后，移植后3、7、14、21 d對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分。每次觀察均在上午10點(diǎn)進(jìn)行，在空闊地觀察大鼠自由活動(dòng)3m in后，分別對(duì)雙后肢評(píng)分，測(cè)量?jī)纱稳∑骄岛笤偻M取其均數(shù)并記錄。

1.2.5 灌注取材和石蠟切片制作：在相應(yīng)觀察時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行灌注固定，以損傷區(qū)為中心取長(zhǎng)約1 cm脊髓段，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4μm，每只標(biāo)本每隔10張連續(xù)切片取1張，共取5張切片。

1.2.6 Brdu單染免疫組化：切片常規(guī)脫蠟、水化后熱抗原修復(fù)，檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中微波加熱至沸騰，當(dāng)溫度降至92℃時(shí)將切片置入，微波爐解凍檔修復(fù)20m in，放置室溫自然冷卻，0.01mol/L PBS沖洗5m in×3次；0.1%Triton-X100破膜，常溫下靜置10m in，0.01mol/L PBS沖洗5m in×3次；3%H2O2孵育10m in以消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，0.01mol/LPBS沖洗5m in× 3次；2mol/L HCl使細(xì)胞變性，DNA雙鏈解開(kāi)顯露抗原，37℃30 m in，0.01 mol/L PBS沖洗5 m in×3次；0.1mol/L硼酸鹽緩沖液，rT 10m in，0.01mol/L PBS沖洗5m in×3次；正常山羊血清封閉，rT 20m in，減少非特異性染色的影響，傾去，勿洗；滴加用抗體稀釋液按1∶100稀釋的一抗（抗Brdu單抗），另一張蓋玻片滴加50μl 0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照；4℃過(guò)夜，PBS洗滌5m in×3次；滴加生物素化二抗，37℃30m in，0.01mol/L PBS洗滌5m in×3次；滴加用鏈霉卵白素過(guò)氧化氫酶復(fù)合物37℃20 m in，0.01mol/L PBS洗滌5m in×3次；滴加DAB顯色，鏡下觀察顯色結(jié)果，用水沖洗以終止顯色反應(yīng)。脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.7 Brdu+GFAP和Brdu+NF-200免疫雙染步驟

切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、破膜、過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶、正常山羊血清封閉同Brdu單染步驟。滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗（GFAP 1:50或NF-200 1:200），另一張蓋玻片滴加50μl 0.01mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜，PBS洗滌5m in× 3次；滴加用0.01mol/LPBS1:500稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔，37℃30m in，0.01mol/L PBS洗滌5m in×3次；滴加用Bufer1:100稀釋的堿性磷酸酶色素-底物BCIP/NBT顯色混合液，鏡下觀察顯色結(jié)果，用水沖洗以終止反應(yīng)，0.01mol/L PBS洗滌5m in×3次；2 N HCL使細(xì)胞變性，DNA雙鏈解開(kāi)顯露抗原，37℃30m in，0.01mol/LPBS沖洗5m in×3次；0.1mol/L硼酸鹽緩沖液，rT 10m in，0.01mol/LPBS沖洗5m in× 3次；正常山羊血清封閉，rT 20m in，減少非特異性背景，傾去，勿洗；滴加用抗體稀釋液按1:100稀釋的一抗（抗Brdu單抗），另一張蓋玻片滴加50μl0.01mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜，0.01 mol/L PBS洗滌5m in×3次；滴加生物素化二抗，37℃30m in，0.01mol/L PBS洗滌5m in×3次；滴加用鏈霉卵白素過(guò)氧化氫酶復(fù)合物37℃20m in，0.01mol/L PBS洗滌；5m in×3次；滴加DAB顯色，鏡下觀察顯色結(jié)果，用水沖洗以終止顯色反應(yīng)。脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。圖像分析：采用Image-pro plus 5.1（Media Cybernetics，美國(guó)）專業(yè)圖像分析軟件，用免疫組化照相顯微鏡攝片后輸入計(jì)算機(jī)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的視野，調(diào)整圖像分析軟件在相同條件下計(jì)算出積分光密度（integralopticaldensity,IOD）和組織面積（area），采用公式1計(jì)算得到平均光密度（mean optical density,MOD），測(cè)量?jī)纱稳∑骄岛笤偻M取其均數(shù)并記錄。

MOD=IOD/area （公式1）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各時(shí)間點(diǎn)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

鏡下觀察剛分離接種的細(xì)胞呈圓形，大小不一，絕大多數(shù)為各系造血干細(xì)胞（圖1A）。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)少量貼壁；48 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量增多，呈簇分布，貼壁的細(xì)胞多呈圓形，少量伸出偽足呈短棒形；72 h后貼壁數(shù)量明顯增多，呈梭形、多角形，伸出較長(zhǎng)偽足，集落分布（圖1B）。隨著換液和傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞得到純化，未貼壁細(xì)胞和貼壁雜細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、單一均勻，融合后呈典型的漩渦狀生長(zhǎng)（圖1C、D）。

BMSCs沒(méi)有特異性表型鑒定，所以我們通常采用多個(gè)表面標(biāo)記物聯(lián)合鑒定的方法。將第5代的BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示CD90陽(yáng)性率為98.17%、CD29陽(yáng)性率為97.95%、CD45陽(yáng)性率為0.06%、CD11b/c陽(yáng)性率為0.84%[9,10]，說(shuō)明該細(xì)胞群大部分處于未分化干細(xì)胞狀態(tài)，用貼壁法分離培養(yǎng)的第5代BMSCs的純度在95%以上[11,12]（圖2）。

2.2 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能BBB BBB評(píng)分

圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

圖2 BMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定結(jié)果

BMSCs移植后3、7、14、21 d分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分。BMSCs移植后3 d各治療組較移植前運(yùn)動(dòng)功能有所恢復(fù)，但與對(duì)照組比較無(wú)明顯差別。BMSCs移植后7 d開(kāi)始，各組運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，B、C、D組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評(píng)分較A組有明顯改善，各治療組之間的評(píng)分也出現(xiàn)顯著性差異，并持續(xù)到細(xì)胞移植后21 d（表1）。

表1 BMSCs BMSCs移植后各組大鼠后肢神經(jīng)功能BBB BBB評(píng)分（x x±s s,,n n==1212）

2.3 Brdu Brdu++免疫組化結(jié)果

A組未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，B、C、D組的損傷脊髓組織均見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，核呈棕黃色或棕色（圖3），在各時(shí)間點(diǎn)上，B組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于C、D組，具有顯著性差異（P＜0.01），且D組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)亦優(yōu)于C組。但B、C、D組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨移植天數(shù)的增加而逐漸減少（表2）。

2.4 Brdu Brdu++GFAP GFAP免疫組化結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在觀察時(shí)間段內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化較為明顯，BMSCs移植后3 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生、肥大，出現(xiàn)在損傷區(qū)域周邊，但未見(jiàn)到雙染陽(yáng)性細(xì)胞。移植后7～21 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生反應(yīng)一直持續(xù)升高，B、C、D組GFAP的陽(yáng)性表達(dá)

圖3 Brdu+免疫組化結(jié)果

B組植入BMSCs后3 d（A）和21 d（B）的Brdu+細(xì)胞（200×）；C組植入BMSCs后3 d（C）和21 d（D）的Brdu+細(xì)胞（200×）；D組植入BMSCs后3 d（E）和21 d（F）的Brdu+細(xì)胞（200×）多于A組（表3），并可見(jiàn)到雙染陽(yáng)性細(xì)胞，但數(shù)量較少（圖4）。

2.5 Brdu Brdu++NF-NF-200200免疫組化結(jié)果

A、B、C、D組在BMSCs移植后3～7 d NF-200表達(dá)增高并不明顯，而且未見(jiàn)到雙染陽(yáng)性細(xì)胞。BMSCs移植后14 d開(kāi)始，B、C、D組的MOD值較A組明顯升高（表4）。經(jīng)BMSCs移植的各實(shí)驗(yàn)組的軸突排列及再生情況要優(yōu)于A組，而且染色要深。BMSCs移植后21 d可以觀察到雙染陽(yáng)性細(xì)胞，但數(shù)量極少（圖5）。

表2 各組大鼠BMSCs BMSCs移植后的細(xì)胞存活數(shù)比較（x x±s s,,n n==55）

表3 BMSCs BMSCs移植后各組GFAP GFAP免疫組化MOD MOD值（x x±s s,,n n==55）

圖4 Brdu+GFAP免疫組化結(jié)果

表4 BMSCs BMSCs移植后各組NF-NF-200200免疫組化MOD MOD值（x x±s s,,n n==55）

圖5 Brdu+NF-200免疫組化結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全骨髓法分離、提取的BMSCs鏡下呈梭形或紡錘形，漩渦狀排列。第5代BMSCs經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定，結(jié)果顯示CD90陽(yáng)性率為98.17%，CD29陽(yáng)性率為97.95%，CD45陽(yáng)性率為0.06%，CD11b/c陽(yáng)性率為0.84%，說(shuō)明分離培養(yǎng)的細(xì)胞不是骨髓中的造血干細(xì)胞，而是BMSCs。

BMSCs移植后3 d，各實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能與對(duì)照組均有不同程度的恢復(fù)，但BBB評(píng)分無(wú)顯著性差異，可能是移植時(shí)間比較短；BMSCs移植后7、14、21 d，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組恢復(fù)明顯，表明BMSCs在脊髓損傷早期自然恢復(fù)基礎(chǔ)上有效促進(jìn)神經(jīng)功能改善，且直接注射組效果最佳，而腰椎穿刺組又優(yōu)于股靜脈注射組，可能與脊髓損傷區(qū)的BMSCs數(shù)量有關(guān)。

BMSCs移植為脊髓損傷患者的治療開(kāi)辟了更為廣闊的前景[13]。之前研究證實(shí)，BMSCs可以作為種子細(xì)胞進(jìn)行移植，它既可以分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子也可以促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和再生[4,14]。BMSCs不僅可以向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，而且還有助于脊髓損傷部位GFAP和NF-200的表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組GFAP和NF-200的MOD值在BMSCs移植后要優(yōu)于對(duì)照組，且直接注射組效果最佳，而腰椎穿刺組又優(yōu)于股靜脈注射組。GFAP主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中，它的增高表明星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、活化，可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子從而促進(jìn)神經(jīng)再生。但星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的過(guò)度增多又會(huì)產(chǎn)生膠質(zhì)瘢痕，阻礙軸突穿過(guò)損傷區(qū)域。NF-200是神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突

骨架的主要成分，它的表達(dá)增高提示神經(jīng)元和軸突的再生、生長(zhǎng)，有利于大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。脊髓空洞周邊組織主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞還有一些神經(jīng)軸突組成。上述說(shuō)明BMSCs可以產(chǎn)生一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有助于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)、增殖和軸突的再生、生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)中多采用脊髓損傷部位直接注射的方法進(jìn)行BMSCs移植[15,16]，這種方法能保證將BMSCs盡可能多地輸送到脊髓損傷區(qū)域，但臨床應(yīng)用卻受到限制。本實(shí)驗(yàn)中直接注射組的大鼠經(jīng)細(xì)胞移植后出現(xiàn)雙后肢癱和尿潴留癥狀加重的現(xiàn)象，人工按摩膀胱排尿的時(shí)間比其他3組都有所延長(zhǎng)，雙后肢功能恢復(fù)情況在3 d后才基本與其他組相近。如果發(fā)生多節(jié)段脊髓損傷則需要多點(diǎn)注射，產(chǎn)生各種并發(fā)癥的危險(xiǎn)會(huì)更高，患者較難接受這種方法進(jìn)行有效治療。

在臨床上迫切需要一種能被患者所接受的BMSCs移植途徑，腰椎穿刺和血管內(nèi)移植或許是不錯(cuò)的方法選擇。血管內(nèi)移植包括靜脈移植[17]和動(dòng)脈移植[18]兩種途徑，動(dòng)脈注入BMSCs治療SCI被脊髓的多節(jié)段動(dòng)脈供血所限制，運(yùn)用這一技術(shù)需要在動(dòng)脈導(dǎo)管介入下才可能完成，有極高的選擇性和技術(shù)上的挑戰(zhàn)性。靜脈移植的操作則更安全和簡(jiǎn)單，但它要經(jīng)過(guò)機(jī)體血液循環(huán)和透過(guò)血腦屏障[19]才能到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，首關(guān)效應(yīng)會(huì)使肺、肝等臟器捕獲大量細(xì)胞，致使到達(dá)損傷區(qū)的細(xì)胞數(shù)量有限。本實(shí)驗(yàn)采用同種異體細(xì)胞移植，模仿自體移植盡可能減少宿主免疫反應(yīng)的發(fā)生，但一部分外源性BMSCs在宿主血液循環(huán)系統(tǒng)中不可避免會(huì)受到免疫細(xì)胞的攻擊，引起機(jī)體免疫反應(yīng)，一部分細(xì)胞被宿主的免疫系統(tǒng)所消除。經(jīng)靜脈移植BMSCs治療大鼠SCI，提示BMSCs可遷移到脊髓損傷處，且可表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)志物——神經(jīng)元特異核蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移率不高，21 d時(shí)約占移植細(xì)胞的4.4%[20]。

本實(shí)驗(yàn)表明，股靜脈注射途徑在三種移植途徑中到達(dá)脊髓損傷區(qū)的數(shù)量最少，腰椎穿刺途徑的移植效率高于前者。部分BMSCs存活在受損脊髓組織的周邊，還有一部分細(xì)胞分布在脊髓組織表面。BMSCs通過(guò)腦脊液進(jìn)入受損脊髓節(jié)段，可能是受損脊髓組織釋放某些趨化因子使細(xì)胞遷移到損傷部位，也可能是由于軟脊膜的破壞細(xì)胞直接進(jìn)入損傷部位。細(xì)胞進(jìn)入到損傷部位的機(jī)制并不十分確切，需要進(jìn)一步明確以提高細(xì)胞移植效率。本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)顯示腰椎穿刺途徑更為理想，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)還需要進(jìn)一步完善，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，且BMSCs多向性分化及歸巢機(jī)制不明確，所以結(jié)果不可避免地出現(xiàn)一些偶然因素。

綜上，腰椎穿刺途徑既可以消除局部直接注射帶來(lái)的各種危險(xiǎn)因素，也能避免股靜脈注射的缺點(diǎn)，可作為細(xì)胞移植的最佳途徑。

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Grafting pathwaysof bonemarrow stromalcell transplantation for treatment of spinal cord injury in rats

ZHAO Xuezheng1,TANG Kai2*

(1.Departmentof Orthopedics,XixiHospitalof Hangzhou,Hangzhou 310023;
2.Departmentof Orthopedics,FirstHospitalof Dalian MedicalUniversity,Dalian 116011,Liaoning,China)

ords:Mesenchymal Stem CellTransplantation;SpinalCord Injury

2095-9958（2015）06-0 246-07

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.03-012

*通信作者：唐開(kāi)，E-mail:dltangkai@126.com