HPLC-ELSD法測(cè)定金線草中β-谷甾醇和胡蘿卜苷含量

樊寶娟，劉雪峰，曾愛國(guó)，常 春，傅 強(qiáng)

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院;2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710061)

金線草作為民間草藥，最早被記載于《本草拾遺》，為蓼科金線草屬植物金線草Antenoron filiforme(Thunb.)Roberty et Vautier，以根或全草入藥［1］，具有涼血止血、清熱利濕、散瘀止痛之功效，主治咯血吐血、胃痛、經(jīng)期腹痛、產(chǎn)后血瘀腹痛、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等［2］。趙友興等［3］從金線草的乙醇提取物中一共分離并鑒定了11個(gè)化合物:谷甾醇、胡蘿卜苷等。其中β-谷甾醇具有降膽固醇、抗癌、抗炎、止咳等作用［3］，胡蘿卜苷在一定濃度下對(duì)經(jīng)氧化損傷后的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的修復(fù)作用［4］。但金錢草中β-谷甾醇及胡蘿卜苷含量測(cè)定方法尚且未見報(bào)道，因這兩個(gè)成分除在紫外末端有吸收外，未見其他紫外吸收峰，用紫外法測(cè)定時(shí)，存在基線漂移不穩(wěn)，響應(yīng)值小等缺點(diǎn)。故本文采用HPLCELSD法［5-6］測(cè)定了金線草中β-谷甾醇和胡蘿卜苷的含量，為金線草的藥用開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters2487-2996高效液相色譜儀，Alltech 2000ES蒸發(fā)光檢測(cè)器，Empower色譜工作站(美國(guó)沃特世公司);Sartorius BS224S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。對(duì)照品及對(duì)照藥材均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供:β-谷甾醇 (批號(hào):110851-200504);胡蘿卜苷(批號(hào):100445-200601);甲醇為色譜純(美國(guó)天地公司)，水為超純水，其他試劑為分析純。金線草藥材自采于陜西秦嶺和巴山地區(qū)。共8批樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇—水(96∶4);體積流量 1.0 mL·min-1;柱溫30℃，漂移管溫度70℃，載氣體積流量1.8 L·min-1，進(jìn)樣體積10μL。在上述條件下，供試品中β-谷甾醇和胡蘿卜苷色譜峰與其他雜質(zhì)峰可達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5。見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-谷甾醇對(duì)照品和胡蘿卜苷對(duì)照品7.64、5.08 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，制成質(zhì)量濃度分別為76.4和50.8 mg·L-1對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，粉碎，取樣品約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入丙酮50 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液低溫蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL，搖勻，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、10、20、25 μL，在上述“2.1”色譜條件下測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得β-谷甾醇對(duì)照品和胡蘿卜苷回歸方程分別為 Y=1.198X+2.076(r=0.999 5)、Y=1.287X+2.985(r=0.999 3)，線性范圍分別為0.152 8 ～1.910 μg 和0.101 6 ～1.270 μg。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察其峰面積，結(jié)果6次β-谷甾醇峰面積的 RSD為1.33%，胡蘿卜苷峰面積的RSD為1.09%，說明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，β-谷甾醇和胡蘿卜苷含量的RSD分別為0.98%和1.08%，結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，20，24 h 測(cè)定，結(jié)果在 24 h 內(nèi)，β-谷甾醇含量的RSD為1.17%，胡蘿卜苷含量的RSD為1.05%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)得含量的樣品6份各0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定體積的混合對(duì)照品溶液，揮干溶劑，再照供試品溶液同法制備，按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果β-谷甾醇6份的平均回收率為99.7%，測(cè)得含量RSD為1.40%，胡蘿卜苷6份的平均回收率為98.9%，測(cè)得含量RSD為 1.77%，見表 1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品測(cè)定 按上述“2.1”色譜條件及“2.2”樣品處理方法，測(cè)定8批樣品，結(jié)果含量見表2。通過含量測(cè)定結(jié)果可看出不同批次藥材的β-谷甾醇及胡蘿卜苷的含量差異較大，分析產(chǎn)生差異的原因可能是不同生長(zhǎng)環(huán)境(氣候、土壤、光照等)不同所致。所以加強(qiáng)藥材來源管理和對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行控制是很有必要的。其有效成分含量高低與環(huán)境因素的相應(yīng)關(guān)系，有待進(jìn)一步研究證明。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑的考察［7－8］本文曾參照相關(guān)文獻(xiàn)［2］采用乙醇做為提取溶劑，但因其極性較大，對(duì)兩個(gè)待測(cè)成分均提取率較低，又分別以甲醇、三氯甲烷、石油醚及丙酮作為提取溶劑，結(jié)果四種溶劑對(duì)同一批藥材中β-谷甾醇的提取量分別為:0.124、0.204、0.209、0.205 mg·g-1，胡蘿卜苷的提取量分別為:0.114、0.079、0.098、0.124 mg·g-1，表明丙酮對(duì)兩個(gè)有效成分的提取效果均佳。因此，選擇丙酮為提取溶劑。

3.2 提取方式的考察［9－10］分別采用加熱回流、索氏提取、超聲提取方法，結(jié)果三種提取方法對(duì)同一批藥材中 β-谷甾醇的提取量分別為:0.205、0.207、0.189 mg·g-1，胡蘿卜苷的提取量分別為:0.124、0.123、0.095 mg·g-1，表明索氏提取及加熱回流提取方法對(duì)兩個(gè)有效成分的提取效果均佳?？紤]到節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，故選用加熱回流提取方法。

3.3 流動(dòng)相考察 β-谷甾醇和胡蘿卜苷極性都比較小，故采用甲醇作為流動(dòng)相，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果出峰時(shí)間比較短，不易使樣品達(dá)到完全分離，后采用不同比例的甲醇—水系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果采用甲醇—水(96∶4)為流動(dòng)相，β-谷甾醇和胡蘿卜苷能與樣品中其他雜質(zhì)峰完全分離，并且峰形良好，保留時(shí)間合適。

金線草在我國(guó)很多地區(qū)都有分布，因其具有祛風(fēng)除濕，理氣止痛，止血，散瘀等功效，在民間有一定應(yīng)用，但因?qū)ζ湎嚓P(guān)化學(xué)成分研究較少，從而限制了這一寶貴中藥資源的有效開發(fā)利用。本文建立了該藥材中的β-谷甾醇和胡蘿卜苷定量分析方法，該方法準(zhǔn)確可靠，專屬性好，重復(fù)性好，為進(jìn)一步開拓金線草藥材的應(yīng)用領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

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