連桂清心片的薄層色譜鑒別

郭俊瑋，宋樂樂

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽蚌埠 233004)

連桂清心片主要由甘草、黃連、丹參、生地等多味藥材組成的復(fù)方制劑，功效以活血化瘀、理氣止痛為主，臨床上主要用于氣滯血瘀所致胸痹、胸悶、心前區(qū)刺痛、舌質(zhì)紫暗以及具有上述癥候的冠心病、心絞痛等病癥。文獻(xiàn)報(bào)道具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)、清心復(fù)脈等功效的連桂清心片，對(duì)心肌缺血有明顯的保護(hù)作用，有重要的開發(fā)價(jià)值［1］。薄層色譜法(TLC)作為色譜法的一個(gè)分支，因其獨(dú)具的設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果直觀、兼具分離鑒定雙重功能等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于藥物分析中，尤其是應(yīng)用于中藥分析。為了有效控制該制劑的質(zhì)量，本文采用薄層色譜法，以甘草酸銨、鹽酸小檗堿為對(duì)照，對(duì)制劑中的甘草、黃連進(jìn)行薄層色譜鑒別試驗(yàn)，建立可用于該制劑質(zhì)量控制的薄層定性鑒別方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(AB204S，梅特勒托利多公司)，超聲波清洗機(jī)(CH250，天津恒奧科技公司，頻率33 kHz)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(CZX－GF101－4－SⅡ，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 連桂清心片(天津中新藥業(yè)集團(tuán)，批號(hào):061106、061108、061110);甘草酸銨對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110731－200306);甘草對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):0904－9605);鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):0713－9906);黃連對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):0913－8802);硅膠G薄層板，規(guī)格100 mm ×100 mm，厚度0.20～0.25 mm(青島海洋化工廠分廠);化學(xué)試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草的薄層色譜鑒別

2.1.1 連桂清心片供試品溶液的制備 取本品15片，研細(xì)，加乙醚40 mL，超聲30 min，濾過，向殘?jiān)屑尤?0 mL甲醇，超聲30 min，過濾，收集濾液，蒸干濾液，向殘?jiān)屑尤?0 mL純凈水使殘?jiān)芙猓褂谜〈既芤禾崛?次，每次使用20 mL正丁醇溶液，合并正丁醇液，用純凈水洗滌3次，蒸干，向殘?jiān)屑尤? mL甲醇使殘?jiān)芙?，以此溶液配置得到連桂清心片供試品溶液。

2.1.2 甘草酸銨對(duì)照品溶液的制備 取甘草酸銨對(duì)照品，加入甲醇制成每1 mL含2 mg甘草酸銨的溶液，以此溶液配置得到對(duì)照品溶液。

2.1.3 甘草對(duì)照藥材溶液的制備 加甲醇30 mL，超聲30 min，過濾，蒸干濾液，向殘?jiān)屑尤?0 mL純凈水使殘?jiān)芙?，使用正丁醇提?次，每次20 mL正丁醇，合并所有正丁醇液，用水洗滌3次，蒸干，向殘?jiān)屑尤? mL甲醇使殘?jiān)芙?，以此配置得到甘草?duì)照藥材溶液。

2.1.4 缺甘草陰性對(duì)照溶液的制備 根據(jù)連桂清心片的處方和工藝制備缺甘草的陰性對(duì)照樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法處理，以此配置得到缺甘草陰性對(duì)照品溶液。

2.1.5 TLC法檢測(cè) 按TLC法(《中國藥典》一部(2010年版)附錄ⅥB)進(jìn)行試驗(yàn)［2］，分別吸取上述方法配置的連桂清心片供試品溶液、甘草對(duì)照藥材溶液、甘草酸銨對(duì)照品溶液以及陰性對(duì)照品溶液各1μL，在硅膠G薄層板上點(diǎn)樣(用0.1%氫氧化鈉溶液快速浸過，取出，晾干，于105℃烘干并活化1 h)，以乙酸乙酯—甲酸—冰醋酸—水(15∶1∶1∶2)作為展開劑，展開，取出硅膠G薄層板，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色變清晰，在365 nm紫外光燈下檢視。配置的連桂清心片供試品溶液色譜中，在與甘草對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置，熒光斑點(diǎn)顯示相同顏色;在與甘草酸銨對(duì)照品溶液色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，熒光斑點(diǎn)顯示相同的橙黃色;分離良好且缺甘草的陰性對(duì)照溶液色譜顯示無干擾，見圖1。

2.2 黃連的薄層色譜鑒別

2.2.1 連桂清心片供試品溶液的制備 取本品1片，研細(xì)，加甲醇5 mL，加熱溶液回流15 min，過濾，濾液中加入甲醇至5 mL，以此溶液作為連桂清心片供試品溶液。

2.2.2 鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品鹽酸小檗堿，加入甲醇中配置成每1 mL溶液含0.5 mg鹽酸小檗堿的溶液，以此作為鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.2.3 黃連對(duì)照藥材溶液的制備 另取黃連對(duì)照藥材粉末50 mg，加甲醇5 mL，加熱回流15 min，濾過，濾液補(bǔ)加甲醇使成5 mL，以此作為對(duì)照藥材溶液。

2.2.4 不含黃連陰性對(duì)照溶液的制備 根據(jù)連桂清心片處方和工藝制備沒有黃連的陰性對(duì)照溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法，以此配置得到不含黃連陰性對(duì)照品溶液。

2.2.5 TLC法檢測(cè) 按照TLC法(《中國藥典》一部(2010年版)附錄ⅥB)試驗(yàn)，分別吸取上述方法配置的連桂清心片供試品溶液、黃連對(duì)照藥材溶液、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液以及不含黃連陰性對(duì)照品溶液各1μL，點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，置一側(cè)加有5 mL氨水的雙槽層析缸中，以苯—乙酸乙酯—異丙醇—甲醇—水(6 ∶3 ∶1.5∶1.5∶0.3)為展開劑，蒸汽預(yù)飽和15 min，上行展開，展距約為8 cm。取出硅膠G薄層板，晾干，在365 nm紫外光燈下檢視。連桂清心片配置的供試品溶液色譜中，在與黃連對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，熒光斑點(diǎn)顯示相同的黃色;在與鹽酸小劈堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，熒光斑點(diǎn)顯示相同的黃色;分離良好且不含黃連陰性溶液色譜顯示無干擾，見圖2。

3 討論

3.1 甘草 甘草為豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch).、脹果甘草(Glycyrrhiza inflta Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根和根莖。具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛和調(diào)和諸藥的作用。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒和緩解藥物毒性、烈性。甘草中含有甘草酸、甘草甜素、二氫黃酮、甘草次酸、光甘草酚和異光果甘草苷等數(shù)百種化合物，其中皂苷類、黃酮類和多糖類是甘草最重要的生理活性成分［3］。三萜類成分具有生理活性強(qiáng)、含量高等特點(diǎn)，已從甘草屬植物中鑒定出61種三萜類化合物，其中45種為皂苷元成分，均為3-β齊墩果烷型化合物的衍生物。三萜類化合物甘草酸及甘草次酸為甘草中主要有效成分，它們都有促腎上腺皮質(zhì)激素的生物活性可用作抗炎藥［3－4］。藥理研究還發(fā)現(xiàn)甘草酸除有抗變態(tài)反應(yīng)活性外，還具有非特異性的免疫加強(qiáng)作用。作為我國重要的中藥資源，甘草以其資源豐富、成分多樣、臨床應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中占據(jù)著重要的位置。隨著對(duì)其化學(xué)成分研究的不斷深入，越來越多的具有藥用價(jià)值的生物活性化合物得以發(fā)現(xiàn)和提取，不同品種甘草之間的生物學(xué)特性及藥理作用也日趨明顯，由此我們提示在科學(xué)研究以及臨床用藥方面應(yīng)加強(qiáng)對(duì)甘草品種的區(qū)分，以使甘草的應(yīng)用價(jià)值得到更進(jìn)一步得提高。此外甘草中還含有烏拉爾甘草皂苷A、烏拉爾甘草皂苷B［5］，這些皂苷均屬于五環(huán)三萜類皂苷中的齊墩果烷型，又稱β-香樹脂烷型。其苷元均為甘草次酸，只是與兩分子葡萄糖醛酸的連接位置或構(gòu)型有所不同，其具體名稱、結(jié)構(gòu)見圖3、表1。這些化合物亦是處方工藝提取的目標(biāo)物質(zhì)。在前處理提取中有文獻(xiàn)采用酸水解制得皂苷元再進(jìn)行薄層鑒別［6］，但由于酸水解條件劇烈且水解后需以強(qiáng)堿調(diào)節(jié)pH因而可能會(huì)造成真正的皂苷元在此過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響鑒別的專屬性和可靠性。本試驗(yàn)中依據(jù)以上皂苷的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)并結(jié)合文獻(xiàn)方法［7－8］，用皂苷提取的通用方法，即先使用無水乙醚提取除去親脂性的雜質(zhì)，殘?jiān)约状汲曁崛V過后蒸干再以水轉(zhuǎn)溶，用正丁醇自水相中萃取、蒸干得總皂苷。

在以正丁醇自水相中萃取總皂苷時(shí)，兩相間產(chǎn)生的乳化層較為嚴(yán)重，影響了萃取操作的進(jìn)行。這是由于皂苷結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有親脂性的苷元和親水性的糖鏈?zhǔn)怪哂幸欢ǖ谋砻婊钚运斐傻?，?jīng)采用一些常用的破乳方法如長(zhǎng)時(shí)間靜置、加熱、向體系中加入少量的水相(水)或有機(jī)相(正丁醇)溶劑發(fā)現(xiàn)效果并不明顯。后依據(jù)鹽析法的原理向水相中加入適量的氯化鈉使水相的溶解能力達(dá)到飽和，經(jīng)試驗(yàn)證明破乳效果良好，乳化層幾乎完全消失。

在以普通硅膠G薄層板展開、顯色后，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)重迭嚴(yán)重、分離度很差，這可能是由于皂苷結(jié)構(gòu)中一些極性較大的基團(tuán)，如苷元上和糖鏈中葡萄糖醛酸的羧基、以及糖鏈中較多的羥基與固定相中的硅醇羥基通過氫鍵締合產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附作用所造成的。通過采用將硅膠G薄層板以0.1%氫氧化鈉溶液快速浸過，取出，晾干，于105℃烘干并活化1 h的方法將固定相中的硅醇羥基位點(diǎn)適當(dāng)?shù)姆忾]、鈍化，經(jīng)試驗(yàn)證明以此法處理后的薄層板展開、顯色后斑點(diǎn)圓整、分離度良好。

經(jīng)薄層展開后以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑在105℃下加熱利用強(qiáng)酸使環(huán)上取代基脫除增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵移位、雙分子縮合等反應(yīng)形成共軛系統(tǒng)，又在酸作用下生成陽碳離子而呈色。由于其苷元母核結(jié)構(gòu)中本身就含有共軛雙鍵，因而呈色較快，斑點(diǎn)顯色清晰后置紫外光燈(365 nm)下檢視其熒光斑點(diǎn)顯示具有較好的鑒別效果，且方法簡(jiǎn)單重現(xiàn)性好。

表1 甘草中主要皂苷化合物

3.2 黃連 黃連為毛茛科植物黃連(Coptis chinensis Franch.)、三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.)或云連(Coptis teeta Wall.)的干燥根莖。清熱燥濕，瀉火解毒。用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢，黃疸，高熱神昏，心火亢盛，心煩不寐，心悸不寧，血熱吐衄，目赤，牙痛，消渴，癰腫疔瘡;外治濕疹，濕瘡，耳道流膿。酒黃連善清上焦火熱。用于目赤，口瘡。姜黃連清胃和胃止嘔。用于寒熱互結(jié)，濕熱中阻，痞滿嘔吐。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，除了其原有的傳統(tǒng)的醫(yī)藥價(jià)值及使用范圍外，黃連中的有效成分及其提取物其尚具有抗炎、抗氧化、抗腹瀉、解熱、降血脂、降血糖、增強(qiáng)人體免疫力以及保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。新的藥理作用及新用途的發(fā)現(xiàn)為黃連這一傳統(tǒng)中藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了可靠的依據(jù)。目前，萸黃連舒肝和胃止嘔。用于肝胃不和，嘔吐吞酸。黃連的主要藥理作用包括抗炎、抗病原體、抗毒素、抗心律失常、抗細(xì)菌、抗腹瀉、鎮(zhèn)靜催眠、降血糖和抗?jié)兊?。黃連的主要有效成分是異喹啉類生物堿，已經(jīng)分離出的生物堿化合物包括小檗堿、巴馬丁、黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿和表小檗堿等［9］，其具體名稱、結(jié)構(gòu)見圖4、表2。這些化合物亦是處方工藝提取的目標(biāo)物質(zhì)。其中以小檗堿的含量最高，可達(dá)10%左右，且以鹽酸鹽的狀態(tài)存在于黃連中。除木藍(lán)堿屬于阿樸芬型外，其余都屬于原小檗堿型，為芐基異喹啉衍生物同時(shí)又都是季銨型生物堿，它們具有明顯的抗菌消炎、抑制腫瘤和心血管活性［10－11］。在試驗(yàn)中依據(jù)它們的溶解性質(zhì)使用甲醇熱回流提取，參考文獻(xiàn)［12］和藥典［2］進(jìn)行展開劑的選擇并確定藥典中黃連藥材鑒別項(xiàng)下所使用的展開劑分離效果較好。選擇鹽酸小檗堿為對(duì)照品進(jìn)行薄層展開，并根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)即具有芳香大共軛體系、剛性共平面結(jié)構(gòu)和含有較多的如甲氧基、偕氧亞甲基等紫外吸收助色團(tuán)因而具有較高的熒光效率，采用置紫外光燈(365 nm)下檢視，結(jié)果表明鑒別效果良好，且方法簡(jiǎn)單重現(xiàn)性好。

表2 黃連中主要生物堿化合物

4 結(jié)論

本文采用TLC法建立了連桂清心片中甘草、黃連主要藥材的薄層色譜鑒別，鑒別方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于連桂清心片的薄層定性鑒別。

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