一株高效甲醛降解菌的分離篩選與降解特性研究

周雪媚，李玉光，陳霜玲，付慧群，姜思朋，王永闊

民政部一零一研究所，北京 100070

一株高效甲醛降解菌的分離篩選與降解特性研究

周雪媚，李玉光*，陳霜玲，付慧群，姜思朋，王永闊

民政部一零一研究所，北京 100070

甲醛是一種被廣泛使用的重要化工原材料和有機溶劑，其35%～40%的水溶液是醫(yī)學(xué)上和科研上常用的防腐劑。然而，甲醛作為一種原生毒素，具有強烈的致癌作用，將其釋放到環(huán)境中不僅嚴重危害人體健康，而且具有極大的環(huán)境風(fēng)險。利用微生物降解甲醛已成為治理甲醛污染的重要方法。為了獲得高效的甲醛降解微生物，該研究采集北京某污水處理廠的活性污泥作為菌種分離源，利用稀釋平板涂布及平板劃線的方法分離純化得到一株能以甲醛為唯一碳源生長的降解菌株，并將其命名為 MCA01（CGMCC11443）。通過對該菌株的菌落形態(tài)和菌株形態(tài)進行觀察，并采用法國生物-梅里埃公司的 VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)及其配套的革蘭氏陰性鑒定板對該菌株進行常規(guī)快速鑒定，結(jié)果顯示，MCA01與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的相似度為99%。利用PCR擴增得到菌株的16S rRNA基因，并基于測序所得序列對菌株MCA01進行了BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果指出此分離菌株與Pseudomonas putida的同源性為100%。綜合上述方法，鑒定所分離的菌株MCA01屬于惡臭假單胞菌。在以甲醛為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對菌株MCA01的甲醛耐受性及降解特性進行了研究，結(jié)果顯示菌株MCA01至少能耐受1 600 mg·L-1的甲醛濃度。當(dāng)甲醛初始濃度≤1 000 mg·L-1時，菌株MCA01能夠在12 h內(nèi)完全降解溶液中的甲醛；當(dāng)甲醛濃度增至1 600 mg·L-1時，菌株MCA01在24 h內(nèi)對甲醛降解率為38.5%。菌株MCA01對甲醛具有良好的降解效率，該研究結(jié)果對殯儀場所內(nèi)防腐廢水等受甲醛污染環(huán)境的微生物治理具有較好的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

甲醛；MCA01；惡臭假單胞菌；降解性能

ZHOU Xuemei, LI Yuguang, CHEN Shuangling, FU Huiqun, JIANG Sipeng, WANG Yongkuo. Isolation and Characterization of A Bacterial Strain with Highly Efficient of Formaldehyde Degradation [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(12): 2040-2044.

甲醛（HCHO）又名蟻醛，是最簡單及最常見的醛類化合物，其分子量為 30.03。甲醛是一種廣泛使用的重要化工原材料和有機溶劑（牛鳳蘭等，2009；劉章現(xiàn)等，2006），而且其35%～40%的水溶液（福爾馬林）是醫(yī)學(xué)上和科研上常用的防腐劑（Martín-Tereso et al.，2009；Nicola et al.，2009），被確認為有效的殺菌和消毒物質(zhì)。甲醛具有高度的水溶性和與生物大分子的高度反應(yīng)性（鹿院衛(wèi)等，2008；周光，2003），經(jīng)呼吸道吸收進入人體的甲醛可與蛋白質(zhì)、氨基及DNA結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，擾亂人體細胞的代謝；損害DNA，引起細胞核的基因突變、DNA單鏈內(nèi)交聯(lián)、DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)、抑制DNA損傷的修復(fù)。甲醛具有強烈的致癌和促癌作用，已被國際癌癥研究機構(gòu)列為第Ⅰ類致癌物質(zhì)——對人致癌物質(zhì)（李艷莉等，2003），在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單上居第二位。因此防治甲醛所帶來的環(huán)境污染已刻不容緩。

目前，消除甲醛的方法主要有物理吸附、化學(xué)反應(yīng)、植物凈化等方法，但這些方法普遍存在降解時間長、成本高等缺點從而限制了其應(yīng)用（李章良等，2011）。微生物法以環(huán)境中的微生物為材料，成本低，效果好，而且無二次污染，成為甲醛防治的重要方法之一。關(guān)于微生物降解甲醛的研究最早始于 1990年，Adroer et al.（1990）分離到的Pseudomonas putida A2能降解250 mg·L-1的甲醛。隨后，國內(nèi)外學(xué)者又陸續(xù)分離到數(shù)十株甲醛降解微生物，如徐云等（2010）報道從土壤中分離得到一株甲醛降解菌，該菌甲醛耐受濃度可達 6000mg·L-1，46 h可將5000 mg L-1甲醛全部降解，35 h可全部降解4000 mg·L-1甲醛；呂陽等（2007）分離出了一株甲醛降解菌假單胞菌（Pseudomonas putida），該菌72 h內(nèi)對26.2 mg·L-1甲醛的降解率為90.46%；黃賽花等（2007）獲得了一株甲醛降解真菌黃曲霉，它能在144 h內(nèi)將1241 mg·L-1甲醛降解99.67%； Qiu et al.（2014）分離了一株Methylobacterium sp.，能耐受60000 mg·L-1的甲醛，在固定化細胞降解甲醛的反應(yīng)器中，以24 h為重復(fù)批次時間，菌液濃度2000 mg·L-1的固定化細胞在反應(yīng)器中能重復(fù)20次降解5000 mg·L-1的甲醛，前19次的甲醛降解率均在80%，且顆粒無破裂現(xiàn)象。

殯儀館內(nèi)遺體防腐廢水是一種特殊的污水，除含有大量病原微生物外，還含有遺體防腐過程中排放出的大量甲醛。本研究的目的是從污水處理廠活性污泥中篩選出高效的甲醛降解菌并對其甲醛降解特性進行初步研究，旨在為其應(yīng)用于殯儀場所內(nèi)防腐廢水的甲醛降解提供有力的菌種資源和科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1培養(yǎng)基及試劑

基本培養(yǎng)基（g·L-1）：KH2PO40.7，K2HPO40.85，(NH4)2SO41.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001；微量元素母液0.1 mL，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

微量元素母液（g·L-1）：H3BO36.0，CoCl2·6H2O 4.0， ZnSO4·7H2O 2.0， MnCl2·4H2O 0.6，Na2MoO4·7H2O 0.6，NiCl2·6H2O 0.4，CuCl2·2H2O 0.2。

乙酰丙酮溶液：50 g 乙酸銨、6 mL 冰乙酸及0. 5 mL乙酰丙酮試劑溶于100 mL水中。此溶液在冰箱內(nèi)保存至少可穩(wěn)定1個月。

1.2甲醛降解菌的篩選及純化

樣品采集：從北京某污水處理廠采集活性污泥作為菌種分離源。

富集培養(yǎng)：將少量污泥樣品置于100 mL無菌生理鹽水中，加玻璃珠振蕩15 min后靜置，取上清液作為接種液。在裝有50 mL基本培養(yǎng)基的250 mL培養(yǎng)瓶中加入終濃度為100 mg·L-1的甲醛作為唯一碳源，接入1 mL的接種液，150 r·min-1、30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，得到第一代培養(yǎng)物；取1 mL第一代培養(yǎng)物接種于新的含有100 mg·L-1甲醛的基本培養(yǎng)基中，150 r·min-1、30 ℃搖床中培養(yǎng)24 h，得到第二代培養(yǎng)物。如此反復(fù)培養(yǎng)至獲得第五代培養(yǎng)物。

菌株分離：采用稀釋平板涂布法進行菌株分離。將稀釋液涂布到含有100 mg·L-1甲醛的固體基本培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d。挑取平板上長出的單菌落，反復(fù)劃線分離進行多次純化，直至得到純菌株。

菌株保存：將純化得到的菌株保存在20%的甘油中，-80 ℃存放。

1.3菌種鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

將分離到的純菌株接種于有100 mg·L-1甲醛的固體基本培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h后，進行菌落形態(tài)觀察。挑取平板上的純菌落，利用青島海博的革蘭氏染色試劑盒（HB8278）進行革蘭氏染色，并利用光學(xué)顯微鏡（Olympus IX71）進行菌株形態(tài)觀察。挑取平板上的純菌落，制備0.5麥氏單位濃度的菌懸液，采用法國生物-梅里埃公司的 VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)及其配套的革蘭氏陰性鑒定板對菌株進行常規(guī)快速鑒定。

1.3.2分子生物學(xué)鑒定

利用DNA提取試劑盒（Aidlab）提取細菌基因組，以16S rRNA基因擴增通用引物27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'和1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'（Lane，1991）進行擴增，PCR反應(yīng)體系25.0 μL，其中，10×Taq Plus Reaction Buffer 2.5 μL，dNTPs（10 μmol·L-1）0.5 μL，引物（25 μmol·L-1）1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.3 μL，純水18.7 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴出約1.5 Kb PCR產(chǎn)物，送至北京中美泰和生物技術(shù)公司測序。測出的序列通過 BLAST在NCBI-GenBank進行同源性比對，選取同源性高的16S rRNA基因序列，利用Culstal X軟件進行多序列比對，并利用Mega 6軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4甲醛降解能力的測定

將篩選出的菌株接種于含 400、1000、1600 mg·L-1甲醛的基本培養(yǎng)基中，150 r·min-1、30 ℃搖床培養(yǎng)。于4、8、12、24 h分別吸取1 mL上述培養(yǎng)液進行甲醛含量測定，檢測甲醛降解情況。甲醛的濃度用乙酰丙酮分光光度法測定（環(huán)境保護部，1992）。上述每個處理分別設(shè)置3個重復(fù)。

2　結(jié)果與討論

2.1甲醛降解菌株的鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

經(jīng)過分離純化后得到一株高效甲醛降解細菌菌株，編號為MCA01。該菌株于30 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落呈圓形，直徑約1～1.5 mm，邊緣規(guī)則，表面光滑濕潤，透明，有光澤，凸起，呈乳白色；革蘭染色結(jié)果為陰性，無芽孢，菌體呈短桿狀。菌落與菌株的具體形態(tài)如圖1所示。

利用可靠性高的VITEK2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)及革蘭氏陰性桿菌鑒定卡（7）對菌株MCA01進行了生理生化鑒定。鑒定與比對結(jié)果顯示，MCA01與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）相似度為99%。具體結(jié)果見表1。

圖1　菌株MCA01的菌落形態(tài)和光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig. 1 Colonial morphology and optical micrograph of strain MCA01

表1　VITEK2 COMPACT系統(tǒng)對菌株MCA01生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification of strain MCA01 by VITEK2 COMPACT systems

2.1.2分子生物學(xué)鑒定

以菌株MCA01的DNA為模板，利用16S rRNA基因的通用引物擴增得到1383 bp的DNA序列，該序列的GenBank登錄號為KU321287。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，測出序列的BLAST結(jié)果顯示，此分離菌株與Pseudomonas putida的同源性為 100%，與蒙氏假單胞菌的同源性為 99%。利用Mega 6軟件將該菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中的 21個相關(guān)種的序列進行分析比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示，分離株MCA01與Pseudomonas putida位于同一個系統(tǒng)發(fā)育的分支。

根據(jù)菌落及菌株形態(tài)特征、生理生化鑒定的結(jié)果以及16S rRNA基因序列分析，菌株MCA01為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。據(jù)國內(nèi)外文獻（Aniza，2000）報道，惡臭假單胞菌除引起動植物尸體的腐敗分解外，某些菌株尚可用于甲苯、甲基對硫磷、嗎啡生物堿等有機物的生物轉(zhuǎn)化或生物降解。在降解甲醛的微生物中，假單胞菌是一類具有突出作用的細菌，它在凈化甲醛的過程中，可以以甲醛為唯一的碳源進行生長（Adroer，1990）。近年來報道了多株屬于假單胞菌屬的甲醛降解菌，如Doronina et al.（1997）分離的P. alcaligenes能降解200 mg·L-1的甲醛、P. putida J3能降解450 mg·L-1的甲醛；Saeed et al.（2005）分離的 4株 P. pseudoalcaligenes（LSW、SSW、NSW和OSS）能降解1850 mg·L-1的甲醛。

2.2甲醛降解能力的測定

將篩選出的菌株MCA01接種到含100 mg·L-1甲醛的基本培養(yǎng)基中，于24 h后利用紫外分光光度計檢測甲醛的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCA01菌株在24 h內(nèi)可完全降解100 mg·L-1濃度的甲醛。

2.3甲醛的降解曲線

將MCA01菌株分別接種于含400、1000、1600 mg·L-1甲醛的基本培養(yǎng)基中，150 r·min-1、30 ℃搖床培養(yǎng)。于4、8、12、24 h分別吸取1 mL上述培養(yǎng)液進行甲醛含量測定，檢測甲醛降解情況，結(jié)果如圖3所示。MCA01菌株能在12 h內(nèi)能完全降解400 mg·L-1及1000 mg·L-1的甲醛。24 h內(nèi)對1600 mg·L-1的甲醛降解率為 38.5%，表明該菌株可耐受高達1600 mg·L-1的甲醛，但是高濃度的甲醛可能殺死了部分MCA01菌體，從而導(dǎo)致細菌生長緩慢，影響了甲醛的降解效率。與已報道的甲醛降解微生物相比，MCA01具有高的甲醛耐受性，且降解速率高。比如，李章良等（2011）分離的Pseudomonas sp. JQ-1在甲醛濃度為50 mg·L-1時，24 h內(nèi)對甲醛的降解率僅為87%；Yamazaki et al.（2001）分離的Methylobacterium sp. MF1降解1200 mg·L-1的甲醛需要200 h；鐘衛(wèi)鴻等（2013）分離的Methylobacterium sp. XJLW 培養(yǎng) 52 h對 1200 mg·L-1的甲醛降解率只達到31%。由此可見，菌株P(guān)seudomonas putida MCA01對高濃度的甲醛溶液可實現(xiàn)快速高效降解，為其在甲醛污染環(huán)境特別是殯儀場所內(nèi)防腐廢水中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖2　菌株MCA01的系統(tǒng)發(fā)育進化樹圖Fig. 2 Phylogenetic dendrogram based on 16S rRNA gene sequences of strain MCA01

圖3　菌株MCA01對不同濃度甲醛的降解率Fig. 3 Effect of the formaldehyde concentrations on degradation rates by strain MCA01

3　結(jié)論

以甲醛為唯一碳源，從污水廠活性污泥中篩選到一株具有甲醛降解能力的菌株 MCA01。通過形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及分子生物學(xué)的分析，確定該菌株為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。對菌株MCA01的甲醛降解特性研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醛初始濃度≤1000 mg·L-1時，菌株MCA01能夠在12 h內(nèi)完全降解溶液中的甲醛；當(dāng)甲醛濃度增至 1600 mg·L-1時，菌株MCA01在24 h內(nèi)對甲醛降解率為38.5%。

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Isolation and Characterization of A Bacterial Strain with Highly Efficient of Formaldehyde Degradation

ZHOU Xuemei, LI Yuguang, CHEN Shuangling, FU Huiqun, JIANG Sipeng, WANG Yongkuo
101 Institute of the Ministry of Civil Affairs, Beijing 100070, China

Formaldehyde is a kind of important chemical raw materials and widely used organic solvent. However, as a native toxin, formaldehyde is seriously harmful to human body health, so it is very urgent to prevent and control the environmental pollution brought by the formaldehyde. Microbial degradation of formaldehyde has become one of the important methods for prevention and control of formaldehyde pollution. In order to provide technical support for the industrialized utilization of formaldehyde degrading bacteria, the activated sludge was collected from a sewage treatment plant in Beijing, as the source for selecting the efficient formaldehyde-degrading bacteria. Using liquid dilution and plate streaking methods, a purified strain that can grow with formaldehyde as the sole carbon source was obtained, and designated as MCA01. Colony of the strain was observed and cells were detected using microscope, and then the routine and rapid identification of the strain was done using French France VITEK 2 COMPACT automatic analysis system. The results showed that MCA01 has a 99% similarity to Pseudomonas putida. BLAST alignment and phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence showed that, the new isolate has the 100% similarity to Pseudomonas putida. On the basis of the above results, it can be suggested that the new isolate belonged to Pseudomonas putida. With formaldehyde as the sole carbon source, the formaldehyde tolerance and degradation characteristics of strain MCA01 were studied. The results show that strain MCA01 could tolerate at least 1 600 mg·L-1formaldehyde concentration. When the initial formaldehyde concentration was equal to or less than 1 000 mg·L-1, strain MCA01 can fully biodegrade all the formaldehyde in the solution within 12 h. When the formaldehyde concentration increased to 1 600 mg·L-1, formaldehyde degradation rate could reach 38.5% within 24 h. In brief, strain MCA01 has good degradation efficiency to formaldehyde, and the results had great scientific significance and application value for the control of the formaldehyde pollution in the environment.

formaldehyde; strain MCA01; Pseudomonas putida; degradation characteristics

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.12.018

X172

A

1674-5906（2015）12-2040-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAC11B03）

周雪媚（1975年生），女，研究員，博士，主要從事殯葬環(huán)境科學(xué)研究。E-mail: zxmcaur@126.com *通信作者。李玉光，E-mail: Liyuguang@126.com

2015-08-24

引用格式：周雪媚, 李玉光, 陳霜玲, 付慧群, 姜思朋, 王永闊. 一株高效甲醛降解菌的分離篩選與降解特性研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2015, 24(12): 2040-2044.