頂空固相微萃取法萃取Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類化合物的條件優(yōu)化

周永妍，李 亞，余愛農(nóng)1′′*

（1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境 工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

頂空固相微萃取法萃取Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類化合物的條件優(yōu)化

周永妍1,2，李 亞2，余愛農(nóng)1′2′*

（1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境 工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

采用頂空固相微萃取對Maillard反應(yīng)體系生成的吡嗪類化合物進(jìn)行萃取，尋找最佳萃取條件。通過正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)篩選合適的萃取頭，探討電解質(zhì)（NaCl）添加量、萃取溫度、萃取時間等因素對萃取效率的影響。以吡嗪類化合物的總峰面積為指標(biāo)，確定頂空固相微萃取最佳條件為：采用75 μm CAR/PDMS萃取頭，在7 mL Maillard反應(yīng)液中加入1.4 g電解質(zhì)NaCl，體系溫度50 ℃條件下萃取30 min，Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類化合物萃取效果最好。該萃取方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值為5.03%，最小值為0.31%，平均值為1.90%，對Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類化合物的測定有良好的重復(fù)性，可以用于Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類物質(zhì)的萃取。

頂空固相微萃??；正交試驗(yàn)；吡嗪類化合物；Maillard反應(yīng)；氣相色譜

Maillard反應(yīng)是食品加工和貯藏過程中的羰基化合物（主要是還原糖類）與氨基化合物在一定溫度條件下發(fā)生的一系列非酶褐變反應(yīng)，又稱為羰氨反應(yīng)[1]。Maillard反應(yīng)是食品在加工和貯藏過程中最常發(fā)生的主要反應(yīng)之一，可生成易揮發(fā)的小分子[2]和棕色的大分子類物質(zhì)類黑精[3]，從而影響食品的風(fēng)味和色澤，因此被廣泛研究。但Maillard反應(yīng)是一系列復(fù)雜的反應(yīng)的集合，其反應(yīng)過程變化較大、揮發(fā)性物質(zhì)含量少、體系穩(wěn)定性差，體系久置不僅會造成揮發(fā)性產(chǎn)物的散逸還可能導(dǎo)致反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行[4]，因此尋找一個能快速萃取同時也適合微量及痕量物質(zhì)的萃取方法十分必要。常見的揮發(fā)性產(chǎn)物萃取法有水蒸氣蒸餾法[5]、同時蒸餾萃取法[6]、吹掃捕集法[7]、超臨界萃取法[8]和頂空固相微萃取法等[9]。頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）具有縮短預(yù)處理時間、基本不使用有機(jī)溶劑、適用pH值范圍大、操作簡便、易于自動化等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品[10]、醫(yī)藥[11]、環(huán)境監(jiān)測[12]等行業(yè)。HS-SPME法已廣泛用于萃取Maillard反應(yīng)中的揮發(fā)產(chǎn)物，例如鐘羅寶等[13]使用HS-SPME對大豆分離蛋白粉Maillard反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取，楊繼等[14]將熱重分析與固相微萃取技術(shù)結(jié)合對葡萄糖/天冬酰胺模擬體系非水相Maillard反應(yīng)進(jìn)行研究等，但鮮見水溶液體系中Maillard反應(yīng)形成的揮發(fā)性物質(zhì)最佳萃取條件的研究。

其他對于水溶液體系中Maillard反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)的萃取方法較常見有傳統(tǒng)的液液萃取法[15]、同時蒸餾萃取法[16]等。相較于固相微萃取法的直接萃取，液液萃取法需要消耗大量的有機(jī)溶劑并進(jìn)行濃縮，對環(huán)境不夠友好，并在濃縮過程中可能造成結(jié)果不準(zhǔn)。同時蒸餾萃取法是Maillard反應(yīng)體系檢測揮發(fā)性物質(zhì)時常使用的一種方法，該法同時加熱樣品所在的水相和萃取揮發(fā)性物質(zhì)所需的有機(jī)相，使揮發(fā)性物質(zhì)被水蒸氣帶出并轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，此方法萃取耗時長，預(yù)處理相對繁瑣復(fù)雜，每次檢測需消耗樣品量比固相微萃取大，對于有大批量樣品需要檢測的場合并不適用。

吡嗪類化合物是Maillard反應(yīng)形成的主要揮發(fā)性化合物，尤其是非含硫氨基酸的Maillard反應(yīng)形成的最主要的揮發(fā)物是吡嗪類化合物[17]，吡嗪類化合物一般具有燒烤、堅(jiān)果等風(fēng)味，在食品風(fēng)味中有重要價值。因此探討用HS-SPME方法萃取吡嗪類化合物的萃取條件，對于研究Maillard反應(yīng)形成的風(fēng)味物質(zhì)具有重要意義。另外，本實(shí)驗(yàn)的Maillard反應(yīng)體系是水溶液體系，因此探討用HSSPME方法萃取吡嗪類化合物的萃取條件對其他水溶液體系中的吡嗪類化合物研究也具有重要參考價值。繼還原糖之后，抗壞血酸是又一個在Maillard反應(yīng)中引起廣泛注意的具有潛在羰基組分的化合物[18]。本實(shí)驗(yàn)選用抗壞血酸/谷氨酸模型體系形成的吡嗪類化合物能反映常見的Maillard反應(yīng)所生成的小分子吡嗪化合物[19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）、PDMS/DVB（65 μm）、CAR/PDMS（75 μm）和PDMS（30 μm） 萃取頭 美國Supelco公司；P170005厚壁耐壓反應(yīng)瓶 北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

抗壞血酸（Vetec? 純度≥99%）、谷氨酸（Vetec? 純度≥99%）、C5～C22正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)物 美國Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；2-甲基吡嗪（純度98%） 百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；2′5-二甲基吡嗪（純度99%） 比利時Acros Organics公司；實(shí)驗(yàn)用水皆為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5975I氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、6890N氣相色譜（帶火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）） 美國Agilent科技有限公司；固相微萃取手動進(jìn)樣器 美國Supelco公司；精密電子天平、PB-21型實(shí)驗(yàn)室pH計 瑞士Startorius公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品的制備參考文獻(xiàn)[19-21]的方法。稱取4.403 0g（25.0 mmol）抗壞血酸和3.678 3g（25.0 mmol）谷氨酸溶于250 mL雙層蒸餾水中，適當(dāng)加熱攪拌并用固體NaOH將溶液pH值調(diào)至8.00（25 ℃），使其完全溶解。溶液密封于250 mL P170005厚壁耐壓反應(yīng)瓶中，在（140±2）℃的油浴中攪拌加熱，反應(yīng)120 min，冷水快速冷卻至室溫，冰箱冷藏，待HS-SPME-GC分析。

1.3.2 萃取條件的優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[22-24]報道以及本課題組前期用頂空固相微萃取對吡嗪類化合物的萃取所做的工作[19]確定正交試驗(yàn)的因素和水平，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.3 HS-SPME采樣

取7 mL反應(yīng)液于15 mL專用萃取瓶中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入適量的NaCl，在實(shí)驗(yàn)選定溫度條件下平衡15 min，推出固相微萃取頭開始萃取，按照實(shí)驗(yàn)安排萃取相應(yīng)時間。平行萃取3 次。

1.3.4 HS-SPME-GC-MS分析

揮發(fā)物用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱分離。固相微萃取頭插入氣相色譜（gas chromatography，GC）進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸4.0 min，采用不分流進(jìn)樣，載氣流量0.9 mL/min。柱室溫度采用程序升溫：40 ℃保溫5 min，再以4 ℃/min升溫至260 ℃，然后以20 ℃/min 升溫至280 ℃。GC-MS接口溫度280℃；質(zhì)譜電子電離（electron ionization，EI）源，電離能70 eV；電子倍增電壓1 753 V；質(zhì)量掃描范圍30～400 u；掃描速率1 scan/s。

1.3.5 HS-SPME-GC-FID分析

固相微萃取頭插入GC進(jìn)樣口在250 ℃條件下解吸4.0min，采用不分流進(jìn)樣，載氣：氮?dú)猓d氣流量0.9 mL/min。柱室溫度采用程序升溫：40 ℃保溫5 min，再以4 ℃/min升溫至260 ℃，然后以20 ℃/min升溫至280 ℃。在相同積分參數(shù)下積分得到峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

C5～C22正構(gòu)烷烴在相同條件下分析，以計算待測化合物的線性保留指數(shù)（linear retention index，LRI）。被分離出來的化合物經(jīng)計算機(jī)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫NIST 08譜庫和Wiley 275譜庫對照，對正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的化合物，計算其LRI與單獨(dú)的GC分析結(jié)果以及文獻(xiàn)值進(jìn)行比較，部分組分采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)輔助定性（Co-GC），最終得出GC檢測出的峰所代表的物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡嗪類化合物的鑒定結(jié)果

以75 μm CAR/PDMS萃取頭，在加入1.4 g NaCl后40 ℃條件下萃取40 min，對Maillard反應(yīng)揮發(fā)性產(chǎn)物中吡嗪類化合物的萃取鑒定結(jié)果見表2。

表2 吡嗪類化合物的鑒定結(jié)果Table2 Identification of pyrazine compoundsounds

2.2 HS-SPME萃取效果正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table3 Results of orthogonal array experimentsments

由表3可知，DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）、PDMS/DVB（65 μm）和CAR/PDMS（75 μm）萃取頭的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均在10%以內(nèi)，30 μm PDMS萃取頭的RSD在25%以內(nèi)，在一般頂空固相微萃取的誤差范圍內(nèi)[27-28]。各因素的主次順序?yàn)檩腿☆^＞NaCl添加量＞萃取溫度＞空列＞萃取時間，最佳組合為A2B1C3D4。根據(jù)對各因素的K值分析可知萃取頭以75 μm CAR/PDMS最佳，其后依次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB，而30 μm PDMS萃取頭幾乎無法萃取吡嗪類物質(zhì)；吡嗪類物質(zhì)的萃取效率隨著溶液中NaCl加入量的增加而提高；萃取溫度50 ℃時的萃取效果較優(yōu)，其次是40 ℃和60 ℃，這兩個溫度的萃取效率與最佳溫度差異較小，30 ℃時最差；萃取時間的極差比誤差小，對萃取效果的影響不大，萃取時間30 min時萃取效率較高。因此由正交試驗(yàn)可知，Maillard反應(yīng)所生成的吡嗪類物質(zhì)較合適的萃取條件為采用75 μm CAR/PDMS萃取頭，每7 mL反應(yīng)液中加入2.1 g NaCl，在50 ℃萃取30 min。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis for the results of orthogonal array experiments

查F值表可知F0.05（3，3）=9.28，F(xiàn)0.01（3，3）=29.46，因表4中萃取頭F＞F0.05（3，3），故萃取頭對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由于萃取時間、萃取溫度、NaCl添加量對正交試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，故由極差從大到小進(jìn)行單因素試驗(yàn)，驗(yàn)證正交試驗(yàn)中因素水平改變對萃取效率的影響規(guī)律，并確定萃取效果最好的條件。因萃取頭對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著，75 μm CAR/PDMS萃取頭是較好的萃取頭，無需驗(yàn)證。

2.3.1 鹽效應(yīng)對萃取效率的影響

圖1 反應(yīng)液中NaCl添加量與峰面積的關(guān)系Fig.1 Relationship between NaCl concentration and peak area

由圖1可知，隨著NaCl添加量的增大峰面積逐漸變大，萃取效果逐漸變好，這與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。這是因?yàn)?，在液相中加入鹽（NaCl）可以減少揮發(fā)性成分在水溶液中的溶解，能使更多的揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)至氣相從而被萃取頭所吸附。但隨著溶液中NaCl含量變大峰面積的增加值卻在逐步變小，這是由于液相中的揮發(fā)性物質(zhì)大部分都進(jìn)入氣相后，繼續(xù)添加鹽對降低揮發(fā)性物質(zhì)的溶解度影響越來越小。由圖1可知，NaCl添加量為1.4 g與2.1 g時對于峰面積的影響不大，但實(shí)驗(yàn)操作中加入2.1g固體NaCl可能覆蓋磁轉(zhuǎn)子使其無法轉(zhuǎn)動，為了避免此情況以及盡量減少額外添加物對反應(yīng)液的影響，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選取NaCl的最終添加量為1.4 g。

2.3.2 萃取溫度對萃取效率的影響

圖2 萃取溫度與峰面積的關(guān)系Fig.2 Relationship between extraction temperature and peak area

由圖2可以看出，在萃取溫度達(dá)到50 ℃之前，萃取溫度升高峰面積逐漸增大，但萃取溫度超過50 ℃后峰面積反而減小，這個規(guī)律與正交試驗(yàn)一致。這是因?yàn)樵谄渌麠l件一致的情況下，溫度的升高有利于吡嗪化合物從溶液中溢出，使氣相中吡嗪化合物的量增多，萃取頭達(dá)到吸附平衡時能吸附更多吡嗪化合物，但過高的溫度會導(dǎo)致萃取頭上的吸附物解吸，因此繼續(xù)升溫萃取效率反而下降。由圖2和正交試驗(yàn)結(jié)果可知最佳萃取溫度為50 ℃。

2.3.3 萃取時間對萃取效率的影響

圖3 萃取時間對峰面積的影響Fig.3 Relationship between extraction time and peak area

雖然時間對本實(shí)驗(yàn)的影響較小，但因正交試驗(yàn)中30 min為最佳萃取時間，為驗(yàn)證萃取時間在30 min以內(nèi)時是否可能存在最佳萃取效率，依據(jù)萃取時間的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)。由圖3可以看出，30 min的萃取效率最佳，這是由于萃取是一個動態(tài)過程，30 min前萃取頭可能并未達(dá)到萃取平衡，而30 min之后由于萃取時間過久造成輕微解吸，也可能是50 ℃條件下長時間萃取導(dǎo)致底物產(chǎn)生變化。

2.4 固相微萃取重復(fù)性的考察

由于找出固相微萃取的最佳萃取條件是為了將其應(yīng)用于具體的Maillard水溶液體系，以研究每種吡嗪類物質(zhì)對體系風(fēng)味的貢獻(xiàn)，因此用每種吡嗪類物質(zhì)占總峰面積的百分比來進(jìn)行重復(fù)性的考察。

采用上述的最佳萃取條件，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，考察固相微萃取法在萃取吡嗪類物質(zhì)時的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。經(jīng)計算，各組分相對含量的RSD最大值為5.03%，最小值為0.31%，平均值為1.90%，說明將固相微萃取技術(shù)用于抗壞血酸體系中吡嗪類物質(zhì)的分析重復(fù)性良好。

表5 Maillard反應(yīng)的分析結(jié)果Table5 Contents of pyrazine compounds in Maillard reaction products

由表5可知，以此谷氨酸與抗壞血酸反應(yīng)體系為例，Maillard體系在140 ℃、120 min反應(yīng)后，經(jīng)檢測，吡嗪類物質(zhì)的相對含量為78.177%，其中2′5-二甲基吡嗪和2′3′5-三甲基吡嗪的相對含量分別為40.381%和20.286%，這些都證明了吡嗪類是非含硫氨基酸Maillard反應(yīng)生成的主要風(fēng)味成分，其對Maillard反應(yīng)風(fēng)味的形成具有極大的貢獻(xiàn)。因此，再次證明了吡嗪類物質(zhì)的萃取條件優(yōu)化對Maillard反應(yīng)風(fēng)味成分的研究具有參考意義。

3 結(jié) 論

與其他萃取方法相比，固相微萃取預(yù)處理簡單，無需消耗有機(jī)溶劑，對環(huán)境友好并可以裝配自動進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)自動化，是一種操作方便結(jié)果準(zhǔn)確的萃取方法，尤其適用于大批量樣品的檢測。在Maillard反應(yīng)體系中檢測所生成的吡嗪類物質(zhì)的量時，其最佳的萃取條件為在7 mL反應(yīng)液中添加1.4 g NaCl，萃取溫度50 ℃的條件下用75 μm CAR/PDMS萃取頭萃取30 min。該法的重復(fù)性良好，可以用于Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類物質(zhì)的萃取和其他水溶液體系小分子吡嗪類物質(zhì)的萃取。

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Optimum Extraction Conditions for Pyrazine Compounds from Maillard Reaction Mixture by Headspace Solid-Phase Microextraction

ZHOU Yongyan1′2′LI Ya2′YU Ainong1′2′*
(1. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province Enshi 445000′China; 2. School of Chemistry and Environmental Engineering Hubei M inzu University Enshi 445000′China)

In order to find optimal conditions for the extraction of pyrazine compounds formed by Maillard reaction by using headspace solid-phase microextraction (HS-SPME)′the appropriate fiber was selected and the effects of electrolyte (NaCl concentration temperature and time on extraction efficiency were investigated by single factor and orthogonal array design methods The best extraction efficiency was achieved by addition of 1.4 g of the electrolyte to 7 mL of the Maillard reaction solution and extraction proceeded for 30 min using 75 μm CAR/PDMS fiber at 50 ℃. The relative standard deviation (RSD of pyrazine compounds extracted by the proposed procedure ranged from 0.31% to 5.03% with an average of 1.90%. The method has a good repeatability and can be used to extract pyrazine compounds formed by Maillard reaction.

headspace solid-phase microextraction (HS-SPME); orthogonal array design pyrazine compounds Maillard reaction gas chromatography

O658.2

A

1002-6630（2015）06-0119-05

10.7506/spkx1002-6630-201506022

2014-05-23

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31360408）

周永妍（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：530129014@qq.com

*通信作者：余愛農(nóng)（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：anyufoodchem@hotmail.com