響應(yīng)面法優(yōu)化半纖維素酶提取梨渣中可溶性膳食纖維工藝

陳小舉，吳學(xué)鳳，姜紹通，李興江′*

（1.巢湖學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

響應(yīng)面法優(yōu)化半纖維素酶提取梨渣中可溶性膳食纖維工藝

陳小舉1′2，吳學(xué)鳳2，姜紹通2，李興江2′*

（1.巢湖學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

以碭山梨渣為原料，采用半纖維素酶水解法從梨渣中提取可溶性膳食纖維，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取條件。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察液料比、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)可溶性膳食纖維提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酶解工藝中各影響因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，半纖維素酶水解法提取梨渣可溶性膳食纖維的最適提取工藝條件為：液料比13∶1（mL/g）、酶解溫度58 ℃、酶解時(shí)間5 h、酶添加量35 U/g。在該條件下可溶性膳食纖維的提取率為15.21%，與理論值相差1.1%，表明實(shí)測(cè)值與理論值之間具有良好的擬合度。梨渣可作為一種優(yōu)質(zhì)膳食纖維的原料，半纖維素酶能有效用于梨渣中膳食纖維的提取。

梨渣；可溶性膳食纖維；半纖維素酶

碭山梨是我國(guó)果品中的名產(chǎn)，年產(chǎn)量40萬(wàn) t左右。碭山梨深加工產(chǎn)品以濃縮果汁、果汁飲料為主，由于梨渣約占果實(shí)質(zhì)量的40%～50%，因此，梨汁生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的梨渣。梨渣中含有石細(xì)胞[1]，直接用作飼料適口性較差，一般常常作為廢料遭到棄丟，造成資源浪費(fèi)。如果能將梨渣進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，不僅能增加企業(yè)的效益，還會(huì)減少梨渣堆積對(duì)環(huán)境造成的污染。

膳食纖維作為一種功能性食品基料日益受到人們的關(guān)注。盡管膳食纖維不能為人體提供任何營(yíng)養(yǎng)，但對(duì)人體具有重要的生理功能。根據(jù)膳食纖維溶解性的不同，將其分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩大類(lèi)。與IDF相比，SDF表現(xiàn)出更強(qiáng)的生理的功能，具有預(yù)防心血管疾病[2-3]、預(yù)防肥胖癥[4]、預(yù)防糖尿病[5]、預(yù)防癌癥[6-7]、抗氧化[8]、清除自由基[9]等生理效應(yīng)。鑒于此，膳食纖維已被廣泛的應(yīng)用于食品中[10-13]。

隨著對(duì)膳食纖維生理功能認(rèn)識(shí)的不斷加深，如何制備膳食纖維也成為了研究的熱點(diǎn)。目前，SDF主要從植物中提取，其所用到的方法主要有：水提取法[14]、化學(xué)法[15]、物理法[16]、微生物發(fā)酵法[17]和酶法[18]等。與其他方法相比，酶法具有條件溫和、操作簡(jiǎn)單、提取率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。半纖維素酶可促進(jìn)纖維素、半纖維素分解，引起植物細(xì)胞壁溶解，使更多的植物細(xì)胞內(nèi)溶物釋放出來(lái)，并能將不易消化的大分子多糖、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)降解成小分子物質(zhì)，可提高水溶性膳食纖維的含量和品質(zhì)[19]。碭山梨中含有大量的膳食纖維，但酶法提取梨渣中膳食纖維的研究報(bào)道較少，尤其是利用半纖維素酶提取梨渣中膳食纖維的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以榨汁后的碭山梨渣為原料，利用半纖維素酶水解法從梨渣中提取SDF，通過(guò)優(yōu)化工藝條件，提高SDF提取率，以期提高碭山梨的綜合利用率，減少環(huán)境污染，為豐富膳食纖維的材料來(lái)源及碭山梨的綜合開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨渣為碭山梨加工下腳料梨皮，梨核及梨渣經(jīng)過(guò)烘干、粉碎過(guò)篩后得到的梨渣粉；半纖維素酶（食品級(jí)，酶活力為150 000 U/g） 江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉與95%乙醇均為分析純；配制用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

L750A型高速多功能搖擺粉碎機(jī) 浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HZQ-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 工藝要點(diǎn)

1.3.2.1 原料預(yù)處理

將濕梨渣在溫度80 ℃條件下烘24 h，至梨渣質(zhì)量恒定得到干梨渣，將干梨渣粉碎，過(guò)60 目篩，得到梨渣粉。

1.3.2.2 半纖維素酶水解

將梨渣粉加入pH 4.6的檸檬酸緩沖液中，加入半纖維素酶，恒溫水浴進(jìn)行酶解，酶解后于100 ℃滅酶5 min，得到梨渣酶解液；將梨渣酶解液真空抽濾，分別收集濾渣和濾液；所述濾渣于溫度80 ℃條件下烘24 h，至濾渣質(zhì)量恒定，粉碎，即得IDF。

1.3.2.3 乙醇沉淀

濾液于60 ℃條件下真空濃縮40～60 min，直至濃縮液為原濾液的四分之一，按體積比1∶4向濃縮濾液中加入無(wú)水乙醇，靜置沉淀24 h，溫度20℃、轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下離心10 min，倒出上清液，收集沉淀，分離出SDF。

1.3.2.4 干燥

將梨渣SDF在溫度60 ℃條件下烘至質(zhì)量恒定，粉碎，過(guò)60 目篩，得到粉狀的梨渣SDF。

1.3.3 SDF提取的單因素試驗(yàn)

采用半纖維素酶水解法提取梨渣中SDF，在pH 4.6的檸檬酸緩沖液反應(yīng)體系中，分別以液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL/g）、酶添加量（13.5、27.0、40.5、54.0、67.5 U/g）、酶解時(shí)間（3、4、5、6、7 h）、酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）為影響因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察其對(duì)膳食纖維提取率的影響。SDF提取率按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

1.3.4 SDF提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各因素影響SDF提取率的結(jié)果做方差分析，選取對(duì)提取率影響顯著的因素，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)以?xún)?yōu)化SDF提取條件，獲得較佳的提取工藝。選取的因素水平及編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table1 Coded values and corresponding experimental values of the optimization parameters used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)SDF提取率的影響

取60 目的梨渣粉3 g于100 mL的燒杯中，加入0.05 mol/L、pH 4.6的檸檬酸緩沖液，將液料比定為6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL/g），然后加入40.5 U/g的半纖維素酶，在50℃恒溫水浴酶解4 h，按1.3.2節(jié)所述進(jìn)行后續(xù)操作，研究液料比對(duì)梨渣中SDF提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 液料比對(duì)SDF提取率的影響Fig.1 Effect of liquid/material ratio on the extraction rate of soluble dietary fiber

由圖1可知，液料比在6∶1～ 14∶1（mL/g）范圍內(nèi)時(shí)，梨渣中SDF提取率隨液料比的增大而升高，由12.98%升高到15.03%；當(dāng)液料比大于14∶1時(shí)，梨渣中SDF提取率隨液料比的增大而呈下降趨勢(shì)。究其原因可能是：液料比小于14∶1時(shí)，酶解反應(yīng)體系黏度較大，提取過(guò)程中攪拌較難操作，導(dǎo)致SDF擴(kuò)散速率較慢，阻礙了酶對(duì)底物的水解，酶與底物反應(yīng)不充分，SDF提取不完全而導(dǎo)致提取率較低；當(dāng)液料比增大至18∶1后，由于反應(yīng)體系過(guò)大，導(dǎo)致單位體積底物含量偏低，不利于酶與底物的結(jié)合，而使SDF提取率呈下降趨勢(shì)[19]。同時(shí)，當(dāng)液料比過(guò)大時(shí)，提取出來(lái)的SDF在溶液中的含量過(guò)低，不僅沉淀劑乙醇的消耗量大，而且沉淀效果也不理想，也會(huì)導(dǎo)致SDF提取率降低。方差 分析的結(jié)果顯示，不同水平的液料比對(duì)SDF提取率的影響顯著（P＜0.05）。在保證試驗(yàn)效果、節(jié)約能耗的前提下，液料比應(yīng)控制在14∶1左右。

2.1.2 酶添加量對(duì)SDF提取率的影響

液料比14∶1、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間4 h的條件下，研究酶添加量對(duì)SDF得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶添加量對(duì)SDF提取率的影響Fig.2 Effect of hemicellulase dosage on the extraction rate of soluble dietary fiber

由圖2可知，酶添加量由13.5 U/g增加到67.5 U/g時(shí)，梨渣中SDF提取率總體上呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在酶添加量為54 U/g時(shí)，SDF提取率達(dá)到最大，為14.97%；當(dāng)酶添加量大于54 U/g時(shí)，梨渣中SDF提取率又呈下降趨勢(shì)。酶添加量在13.5～27 U/g范圍內(nèi)時(shí)，SDF提取率呈下降趨勢(shì)，究其原因可能是由于操作誤差；當(dāng)將酶添加量由27 U/g增加到54 U/g時(shí)，反應(yīng)體系中半纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的破環(huán)程度隨酶添加量的增大而增大， 細(xì)胞內(nèi)膜的通透性增加，傳質(zhì)阻力降低，同時(shí)，部分IDF也被酶解成小分子，溶解度增大，使部分IDF轉(zhuǎn)變成SDF，因此，SDF提取率呈增加趨勢(shì)[20-21]。而當(dāng)酶用量過(guò)大時(shí)，在IDF水解得到可溶性成分的同時(shí)，部分可溶性大分子也被降解為醇溶性小分子物質(zhì)，導(dǎo)致SDF提取率下降[22]。方差分析的結(jié)果顯示，不同水平的酶添加量對(duì)SDF提取率的影響顯著（P＜0.05）。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響

液料比14∶1、酶解溫度為50℃、酶添加量54 U/g的條件下，研究酶解時(shí)間對(duì)SDF得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of soluble dietary fiber

圖3 結(jié)果顯示，當(dāng)酶解時(shí)間小于5 h時(shí)，SDF提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；在5 h時(shí)，SDF提取率達(dá)到最大，為13.69%；酶解時(shí)間大于5 h后，SDF提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這是因?yàn)?，? h以前，酶解時(shí)間過(guò)短，酶與底物反應(yīng)不充分，所以SDF提取率較低，此時(shí)，SDF主 要成分為果膠；當(dāng)酶作用時(shí)間在5 h左右時(shí)，酶解反應(yīng)已基本完成，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，就會(huì)將SDF轉(zhuǎn)變?yōu)榇既苄孕》肿游镔|(zhì)，導(dǎo)致SDF提取率下降[21′23-24]。方差分析的結(jié)果顯示，酶解時(shí)間的變化對(duì)SDF提取率的影響高度顯著（P＜0.01）。

2.1.4 酶解溫度對(duì)SDF提取率的影響

液料比14∶1、酶解時(shí)間5 h、酶添加量54 U/g的條件下，研究酶解溫度對(duì)SDF得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解溫度對(duì)SDF提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of soluble dietary fiber

圖4 結(jié)果顯示，酶解溫度對(duì)梨渣SDF提取率的影響較大。在30～50℃范圍內(nèi)時(shí)，隨溫度的升高，SDF提取率也升高；而在50℃以后，SDF提取率隨溫度的升高而降低，50℃時(shí)SDF達(dá)到最大，為14.24%。半纖維素與纖維素之間有較強(qiáng)的氫鍵，提取過(guò)程中破環(huán)氫鍵需要有較強(qiáng)的能量，溫度升高，有利于纖維素與半纖維素之間氫鍵的破環(huán)，使半纖維素的溶解加強(qiáng)，SDF提取率也隨之增加[25]；半纖維素酶的較適反應(yīng)溫度范圍為30～60 ℃，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，半纖維素酶變性失活，SDF提取率也隨之降低，所以選取50℃為提取SDF的最佳提取溫度。方差分析的結(jié)果顯示，酶解溫度的變化對(duì)SDF提取率的影響高度顯著（P＜0.01）。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，不同試驗(yàn)因素對(duì)梨渣SDF提取率的影響有所不同。對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的方差分析發(fā)現(xiàn)：酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液料比對(duì)SDF提取率的影響均為顯著。因此，選用以上因素作為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)以?xún)?yōu)化提取條件，以SDF提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定半纖維素酶提取梨渣中SDF的較適條件。

2.2.1 模型的建立與顯著性分析

Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)表2中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

因素經(jīng)回歸擬合，得到回歸方程為：

Y=—108.509 69＋2.161 21A＋16.614 17B＋1.949 37C＋0.486 12D—2.75×10—3AB—8.56×10—3AC—9.4×10—3AD—0.144BC＋0.022BD＋0.018CD—0.015A2—1.53B2—0.053C2—5.008×10—3D2

由回歸模型方差分析可知，回歸模型P值均小于0.000 1，達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明該模型顯著回歸，方程能夠正確反映梨渣SDF提取率與各因素之間的關(guān)系。模型的失擬項(xiàng)P值為0.228 4，大于0.05，表示其不顯著，說(shuō)明回歸模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)誤差小，不存在其他未考慮到的影響因素。一次項(xiàng)A、C、D及二次項(xiàng)A2、B2、C2和交互項(xiàng)AD表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明這幾個(gè)因素對(duì)SDF提取率影響極大，且所考察因素對(duì)響應(yīng)值影響不是簡(jiǎn)單的一次線(xiàn)性關(guān)系。交互項(xiàng)除AB、BD外都顯著。根據(jù)F值大小，可知影響因素的主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋久柑砑恿浚疽毫媳龋久附鈺r(shí)間。此模型為0.963 7，表明有96.37%的提取率變異分布在所研究的4個(gè)相關(guān)因素中；多元相關(guān)系數(shù)R2為0.981 2，表明實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值間有很好的擬合度。方差分析結(jié)果表明采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)所得的回歸模型有效，可適用于梨渣SDF提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化方案與結(jié)果Table2 Box-Behnken design arrangement and corresponding experimental ressuullttss

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table3 Significance test and analysis of variance for the regression model for enzymatic extraction off SSDDFF

2.2.2 響應(yīng)面及等高線(xiàn)分析

響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖能夠直觀地反映出各個(gè)因素及其交互作用，利用Design-Expert 8.0.5b軟件即可以作出兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)SDF提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on the extraction rate of SDF

從圖5可以看出，除圖5c外，圖5a、b、d、e、f曲面圖均顯示出：隨著各因素水平的升高或延長(zhǎng)，SDF提取率先增加后減少。圖5a、b、c的等高線(xiàn)圖顯示，等高線(xiàn)沿酶解溫度軸向變化相對(duì)密集，而沿酶解時(shí)間、液料比與酶添加量軸向變化相對(duì)稀疏，再結(jié)合曲面圖的陡峭程度，可得出：酶解溫度對(duì)提取率的影響要大于酶解時(shí)間、液料比與酶添加量。同理，圖5d、e的曲面圖和等高線(xiàn)圖顯示酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響要弱于酶添加量和液料比；圖5f響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖顯示酶添加量對(duì)SDF提取率的影響要大于液料比。再次驗(yàn)證了單因素與交互項(xiàng)對(duì)SDF提取率的影響的主次順序。

2.2.3 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

經(jīng)Design-Expert 8.0.5b分析優(yōu)化，可得到酶法提取梨渣中SDF的最佳工藝條件為液料比13∶1、酶解時(shí)間5.02 h、酶解溫度57.59 ℃、酶添加量35 U/g。在此條件下，根據(jù)方程得到SDF提取率的預(yù)測(cè)值為15.38%。

表4 優(yōu)化條件下的SDF提取率TTable 4 The extraction rate of SDF under optimized extraction condittiioonnss %

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性，采用優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行酶法提取梨渣中SDF的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性，將實(shí)驗(yàn)條件設(shè)為液料比13∶1、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度58 ℃、酶添加量35 U/g，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，采用上述優(yōu)化條件提取時(shí)，SDF提取率是15.21%，與理論值相差1.1%，這說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化的條件是可行的，有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明酶解溫度、酶添加量、液料比與酶解時(shí)間對(duì)碭山梨渣中SDF提取率的影響顯著。試驗(yàn)方差分析表明影響SDF提取率的因素主次順序?yàn)椋好附鉁囟龋久柑砑恿浚疽毫媳龋久附鈺r(shí)間。

碭山梨渣中SDF提取的較佳工藝條件為液料比13∶1、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度58 ℃、酶添加量35 U/g，在此條件下SDF提取率為15.21%，與理論值相差1.1%，結(jié)果表明實(shí)測(cè)值與理論值之間具有良好的擬合度。本實(shí)驗(yàn)所得模型對(duì)于優(yōu)化碭山梨渣SDF半纖維素酶法提取工藝是合理的。

梨渣可作為一種提取優(yōu)質(zhì)膳食纖維的原料，半纖維素酶可有效作用于梨渣細(xì)胞壁，加速SDF的溶出，可用于梨渣SDF的提取。

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Applying Response Surface Methodology to Optimize Extraction of Soluble Dietary Fiber from Pear Residue Using Hemicellulase

CHEN Xiaoju1,2′WU Xuefeng2′JIANG Shaotong2′LI Xingjiang2′*
(1. School of Chemical Engineering and Life Sciences Chaohu University Chaohu 238000′China; 2. School of Biotechnology and Food Engineering Hefei University of Technology Hefei 230009′China)

Soluble dietary fiber (SDF was extracted from pear residue by hemicellulase hydrolysis The optimum extraction conditions for SDF were determined using response surface methodology (RSM). The effects of four crucial parameters including liquid/material ratio hemicellulase dosage hydrolysis temperature and time on the extraction rate of SDF were investigated by single factor experiments A Box-Behnken design (BBD consisting of 29 experimental points with five replications at the center point was used to investigate the interactive effects of the four independent variables at three levels ranging from 10:1 to 18:1′from 35 to 55 U/g from 40 to 60 ℃′and from 4 to 6 h respectively on extrac tion efficiency The maximum extractio n rate of SDF (15.21%)′which agreed with the predicted value (15.38%)′was obtained when the extraction experiment was carried out for 5 h at 58 ℃ with a hemicellulase dosage of 35 U/g at a liquid/material ratio of 13:1 (mL/g). Thus it is feasible to use hemicellulase to extract SDF from pear residue.

pear residue soluble dietary fiber hemicellulas

TS201.1

A

1002-6630（2015）06-0018-06

10.7506/spkx1002-6630-201506004

2014-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101352）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470002）；巢湖學(xué)院科研啟動(dòng)項(xiàng)目（KYQD-201402）

陳小舉（1984—），男，博士，研究方向?yàn)樯镔Y源綜合利用。E-mail：chenxiaoju2012@hotmail.com

*通信作者：李興江（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工程。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn