顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉體內(nèi)22種金屬含量的測(cè)定及初步分析

閆學(xué)春，覃東立，欒培賢，曹頂臣，何立川

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；3.淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070）

顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉體內(nèi)22種金屬含量的測(cè)定及初步分析

閆學(xué)春1,2,3，覃東立1，欒培賢1,2,3，曹頂臣1,2,3，何立川1,2,3

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；3.淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070）

通過(guò)微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和普通鯉（Common carp）肌肉中Ga、Cu、Zn、Fe、Se、Mn、Cr、Mo、Co、Ni、V、Sn、Sr、Al、Ti、Ag、W、Tl、Bi、Hg、Cd、Pb等22種金屬元素的含量，比較分析顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和普通鯉肌肉中金屬元素富集情況。結(jié)果表明，除顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉家系C中Zn元素含量略高于普通鯉外，其他金屬元素含量均低于普通鯉。統(tǒng)計(jì)分析表明顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉對(duì)金屬元素富集能力與普通鯉相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。同時(shí)，本研究中顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和普通鯉重金屬Cu、Zn、Cr、Hg、Cd、Pb含量均符合相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求。

顯微介導(dǎo)；中國(guó)對(duì)蝦；鯉；金屬含量

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-12-25 13:11:05[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151225.1311.046.html

閆學(xué)春,覃東立,欒培賢,等.顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉體內(nèi)22種金屬含量的測(cè)定及初步分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46 (12):65-71.

Yan Xuechun,Qin Dongli,Luan Peixian,et al.Detection and pilot analysis of 22 metal in Chinese shrimp total DNA microinjected common carp(Cyprinus carpio)[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(12):65-71.(in Chinese with English abstract)

顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉是將中國(guó)對(duì)蝦總DNA導(dǎo)入鯉魚受精卵內(nèi)，通過(guò)基因組水平的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)改善鯉魚品質(zhì)，獲得基因組水平遠(yuǎn)緣雜交魚。魚類遠(yuǎn)緣雜交（Distant hybridization）是魚類育種研究基本方法之一，是通過(guò)有性雜交培育魚類優(yōu)良新品種實(shí)現(xiàn)魚類間基因交流的傳統(tǒng)育種方式[1-3]。使基因組從一條魚轉(zhuǎn)移到另一條魚中，從而導(dǎo)致雜交后代表現(xiàn)型和基因型發(fā)生改變，在遺傳育種和生物進(jìn)化方面具有重要作用[4]。盡管魚類遠(yuǎn)緣雜交比較容易，但產(chǎn)生雜交不育后無(wú)法雜交利用得到改良品種。顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，外源基因高水平表達(dá)改善品質(zhì)性狀低。因此，顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)是獲得鯉魚類品質(zhì)改良新品種的可行途徑。本研究以通過(guò)該技術(shù)獲得品質(zhì)性狀優(yōu)良的顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉新品系為研究對(duì)象[5]，探討實(shí)際應(yīng)用效果。

鯉魚作為人類重要?jiǎng)游锏鞍讈?lái)源，是世界淡水養(yǎng)殖業(yè)重要魚類之一，隨著鯉魚產(chǎn)銷量的提高，應(yīng)考慮食用安全性。有研究表明，水生動(dòng)物對(duì)金屬和重金屬等微量元素具有較強(qiáng)富集作用[6-9]。殘留在水產(chǎn)品中有害微量元素隨食物鏈的富集對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[10-11]。大部分重金屬元素對(duì)魚類自身的生命活動(dòng)也有傷害[11-12]。因此，研究魚體金屬元素含量，既可反映魚類生理特點(diǎn)，又可預(yù)測(cè)水環(huán)境中重金屬元素污染狀況，無(wú)論從環(huán)境監(jiān)測(cè)，毒理評(píng)價(jià)還是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等方面，魚類等水產(chǎn)品中微量元素檢測(cè)十分必要[13-16]。魚類的重金屬元素中，研究最多的是鎘、鋅、銅3種，其次是鉛、鐵[17-18]。

自1985年世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚在我國(guó)問(wèn)世以來(lái)，學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)基因魚開(kāi)展廣泛研究[19]。如孫效文等用直接顯微注射法獲得轉(zhuǎn)全魚基因鯉[20]；Chourrout成功地將外源生長(zhǎng)激素基因?qū)牒琪V魚受精卵，并獲得轉(zhuǎn)基因虹鱒魚[21]；Chen等使用虹鱒魚的生長(zhǎng)基素基因eDNA片段構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鯉魚[22]。作為一種新的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，加快魚類育種的速度，但隨之而來(lái)的是轉(zhuǎn)基因安全問(wèn)題，主要包括食用安全和生態(tài)安全。有關(guān)轉(zhuǎn)基因鯉的食用安全性研究已有報(bào)道[23-24]。梁利群等研究自然水域?qū)D(zhuǎn)基因鯉同種或相近種的遺傳背景影響，以及轉(zhuǎn)基因鯉子代與正常鯉子代生存競(jìng)爭(zhēng)能力，認(rèn)為轉(zhuǎn)大馬哈魚生長(zhǎng)激素基因鯉具有生態(tài)安全性[25]。

本研究作為轉(zhuǎn)基因鯉食用安全研究的一部分，檢測(cè)分析其體內(nèi)金屬微量元素，以了解顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的金屬元素富集狀態(tài)和對(duì)池塘生態(tài)影響，同時(shí)也為顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的研究提供依據(jù)，并為其安全性評(píng)價(jià)提供借鑒。

1　材料與方法

1.1材料

測(cè)定金屬元素試驗(yàn)材料取自黑龍江水產(chǎn)研究所遺傳育種與生物技術(shù)研究室生產(chǎn)的1周齡顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和普通鯉，中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)基因鯉分3個(gè)家系。3個(gè)家系和對(duì)照家系試驗(yàn)魚分別飼養(yǎng)在4個(gè)臨近的0.053 hm2池塘。試驗(yàn)魚在4個(gè)池塘各取30尾。家系A(chǔ)、家系B和家系C的平均體重分別為190.86、197.92和224.71 g；普通鯉的平均體質(zhì)量為217.39 g。

1.2儀器及試劑

儀器：電感耦合等離子體質(zhì)譜儀7500CX（美國(guó)安捷倫公司），配置八級(jí)桿碰撞/反應(yīng)池系統(tǒng)；微波消解儀MARSX（美國(guó)CEM公司）；純水器（美國(guó)Millipore公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：Ga、Cu、Zn、Fe、Se、Mn、Cr、Mo、Co、Ni、V、Sn、Sr、Al、Ti、Ag、W、Tl、Bi、Hg、Cd、Pb和Au標(biāo)準(zhǔn)溶液（各1000ug·mL-1），均由國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心提供；硝酸、鹽酸均為優(yōu)級(jí)純，由美國(guó)默克（Merck）公司提供；內(nèi)標(biāo)溶液（含Li、Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu、Bi各100 ug·mL-1）和調(diào)諧液（含Li、Y、Ce、Tl、Co各10 ug·mL-1）均由美國(guó)安捷倫公司提供；試驗(yàn)用水為純水器處理的去離子水。

1.3試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前用10%（v/v）硝酸浸泡玻璃器皿過(guò)夜后，將玻璃器皿取出，超純水沖洗3遍，烘干備用；將10 mL質(zhì)量濃度為65%硝酸加入樣品消解罐中清洗，首先加蓋密封消解罐，再放入微波消解儀中，按樣品消化程序加熱，冷卻后，倒出硝酸溶液，用超純水沖洗3次，烘干備用。

1.4樣品消解

剪取試驗(yàn)魚背部肌肉0.5 g，放入樣品消解罐中，加入2.5 mL質(zhì)量濃度65%硝酸，0.5 mL 37%鹽酸和7.0 mL超純水。微波消解程序?yàn)椋何⒉üβ? 600 W，爬升溫度185℃，升溫時(shí)間10.5 min，保持時(shí)間14.5 min。消解完成后，將消解液移入50 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)液（100 ug·L-1）0.5 mL，Au溶液（10 mg·L-1）0.5 mL，定容至50 mL。同時(shí)做樣品空白溶液。

1.5儀器分析條件

消解后樣品和試劑空白用ICP-MS檢測(cè)。分析前，儀器用調(diào)諧液調(diào)諧至最佳狀態(tài)。典型離子7Li+和205Tl+響應(yīng)值分別大于8 000-1 s和20 000 s-1，氧化物產(chǎn)率CeO+/Ce+＜1%，雙電荷產(chǎn)率Ce2+/Ce+＜3%；在He碰撞模式下。典型離子59Co+和89Y+響應(yīng)值均大于5 000 s-1，而離子78Ar+和75ArCl+響應(yīng)值均低于30s-1，51ClO+/59Co+小于3%。儀器工作參數(shù)見(jiàn)表1。

表1　ICP-MS工作參數(shù)Table 1Operating parameters of ICP-MS

2　結(jié)果與分析

2.1金屬元素含量水平及分析

顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的3個(gè)家系及普通鯉中Ga、Cu、Zn、Fe等22種金屬元素含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。Zn、Fe、Al、Cu 4種元素含量在各組中均較高，必需微量元素Zn、Fe含量高于非必需微量元素Al；有害微量元素Hg、Pb、Cd含量較低，在家系A(chǔ)和家系B中均未檢出Pb、Cd含量。

圖1是4個(gè)家系金屬元素含量柱狀圖直觀比較，22種元素中，只有16種金屬元素在4個(gè)家系中全部檢出。

2.2安全性評(píng)價(jià)

3個(gè)家系和對(duì)照家系肌肉中6種重金屬含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。

根據(jù)我國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[26-27]規(guī)定，魚體內(nèi)Cr、Hg、Pb、Cd和Cu含量分別不得高于2.0、0.3、0.5、0.1和50 mg·kg-1（濕重）；根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織提供的魚類重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)，魚體內(nèi)Zn含量不得超過(guò)40 mg·kg-1[28]。結(jié)果表明，3個(gè)家系和對(duì)照家系肌肉中Cr、Hg、Pb、Cd、Cu、Zn平均含量均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，均未超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值，且全部低于標(biāo)準(zhǔn)值的一半（見(jiàn)圖3）。

2.3肌肉中重金屬含量差異

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，家系A(chǔ)中Cu、Zn、Fe、Sr、Al、Ti；家系B中Sr、Ti和家系C中Cu、Sr、Ti金屬含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），3個(gè)家系中其他元素含量差異不顯著（P＞0.05）。

表2　顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與普通鯉肌肉中金屬元素含量比較Table 2Comparisons between metal contents of muscles of Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps(mg·kg-1)

圖1　顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與普通鯉金屬元素柱狀圖Fig.1Histograms of metal contents of Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps

表3　顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉重金屬含量及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3Heavy metal contents of Chinese shrimp total DNA microinjected common carp and relative assessment standards(mg·kg-1)

圖2　顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與普通鯉金屬元素含量比較值Fig.2Comparisons of metal contents of Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps

圖3　顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與普通鯉金屬元素占標(biāo)準(zhǔn)值的百分比值Fig.3The percentages of metal contents in Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps relative to the safety standards

3　討論與結(jié)論

金屬元素與人體健康關(guān)系密切，魚類在生存過(guò)程中，既要從水和食物中吸收生命必需元素，也吸收非生命必需元素，如果有毒有害金屬元素在魚類機(jī)體過(guò)量積累，會(huì)使供人類食用的魚類成為濃縮毒素的載體，危及人類健康。盡管許多研究表明魚類肝臟、鰓以及其他內(nèi)臟器官中殘留的重金屬比肌肉中高[29-32]，但由于人們通常食用魚類肌肉組織，本研究中選擇魚體肌肉組織作為金屬殘留的檢測(cè)對(duì)象以評(píng)價(jià)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉食用安全性。結(jié)果顯示，在所測(cè)3個(gè)家系和對(duì)照家系中，重金屬Cu、Zn、Cn、Hg、Cd、Pb含量符合相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求。據(jù)Pourang報(bào)道導(dǎo)致不同種魚肌肉中重金屬含量存在差異的主要因素有：食性、生長(zhǎng)速率、環(huán)境溫度、水質(zhì)硬度和鹽度、年齡、性別以及金屬元素間相互作用等[33]。本研究的3個(gè)家系和對(duì)照家系采自相同的養(yǎng)殖環(huán)境，即注入水、投喂飼料以及池塘無(wú)差異。分析原因，不同家系魚肌肉中金屬元素含量差異可能與其生長(zhǎng)速率、食性等因素有關(guān)。攝食旺盛的魚在快速生長(zhǎng)時(shí)，為滿足較大營(yíng)養(yǎng)需求、快速新陳代謝和正常生理發(fā)育，對(duì)必需元素和非必需元素需求也會(huì)隨之增加，吸入金屬元素含量相對(duì)較多，金屬元素的累積隨之增多，反之金屬元素含量累積相對(duì)較少。閆學(xué)春等研究金屬硫蛋白基因?qū)D(zhuǎn)基因鯉及試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)重金屬累積影響，分析轉(zhuǎn)基因鯉與非轉(zhuǎn)基因鯉體內(nèi)的重金屬含量，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鯉體內(nèi)重金屬含量增加[17]。這一點(diǎn)與本試驗(yàn)結(jié)果相同。不同之處是試驗(yàn)魚所用轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因是單個(gè)基因轉(zhuǎn)移，經(jīng)過(guò)修飾，而本試驗(yàn)魚所轉(zhuǎn)總DNA是多基因的轉(zhuǎn)移，是未經(jīng)遺傳修飾的基因。相同點(diǎn)是試驗(yàn)魚均能克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，均使外源DNA片段在轉(zhuǎn)化受體中整合。從安全性考慮，作為未經(jīng)過(guò)遺傳修飾的顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉風(fēng)險(xiǎn)較小。

重金屬在魚體內(nèi)累積主要與生活水環(huán)境有關(guān)，同一水體，魚類因種類、規(guī)格、重金屬污染物及生存條件不同，累積狀況也不同。魚對(duì)重金屬吸收積累主要通過(guò)鰓呼吸及魚體表面吸附和消化系統(tǒng)吸收等，當(dāng)重金屬在魚體內(nèi)累積量超標(biāo)時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出一定毒性效應(yīng)，破壞魚體內(nèi)酶活性，危害魚類健康生長(zhǎng)，甚至造成魚畸變或死亡。顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與普通鯉一樣，重金屬類毒害作用主要體現(xiàn)在免疫、呼吸強(qiáng)度、呼吸運(yùn)動(dòng)、生理生化作用及對(duì)魚類基因毒性作用影響，不僅影響魚類正常生長(zhǎng)發(fā)育，還通過(guò)生物鏈作用進(jìn)一步威脅人類健康[18]。

本試驗(yàn)表明，顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與普通鯉相比并沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明中國(guó)對(duì)蝦總DNA滲入僅起改善鯉魚品質(zhì)作用，并沒(méi)有增加顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉魚體內(nèi)重金屬元素富集。

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Detection and pilot analysis of 22 metal in Chinese shrimp total DNA microinjected common carp(Cyprinus carpio)

YAN Xuechun1,2,3,QIN Dongli1, LUAN Peixian1,2,3,CAO Dingchen1,2,3,HE Lichuan1,2,3(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institue,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.National Local Joint Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding,Harbin 150070，China;3.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding,Harbin 150070,China)

The metal contents(Ga,Cu,Zn,Fe,Se,Mn,Cr,Mo,Co,Ni,V,Sn,Sr,Al,Ti,Ag,W,Tl, Bi,Hg,Cd,Pb)of muscles of both Chinese shrimp total DNA microinjected and usual common carps were determined by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry,and then the metal contents of muscles were compared between these common carps.The results showed that metal contents of microinjected common carp were generally less than these of usual common carp, except the Zn content in family C of microinjected common carp was slightly more than it in usual common carp.The statistical analysis suggested that there was no significant difference(P＞0.05)between microinjected and usual common carps on the enrichment of metal in muscles.Meanwhile,the heavy metal contents(Cu,Zn,Cr,Hg,Cd,Pb)of both microinjected common carp and usual common carp complied with relevant food safety standards.

microinjection;common carp(Cyprinus carpio);Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis);metal content

S917.4

A

1005-9369（2015）12-0065-07

2015-06-15

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100404）；淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（2014NLJELFFB-03）

閆學(xué)春（1964-），男，研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與基因工程育種。E-mail:yanxc8@163．com