不同亞型天皰瘡患者血清對(duì)HaCaT細(xì)胞橋粒芯糖蛋白3表達(dá)的影響

李 惠林 麟張潔塵馮素英周武慶弓娟琴王寶璽

·論著·

不同亞型天皰瘡患者血清對(duì)HaCaT細(xì)胞橋粒芯糖蛋白3表達(dá)的影響

李 惠1，2林 麟1?張潔塵1馮素英1周武慶1弓娟琴1王寶璽1

目的: 確定3例不同亞型天皰瘡患者(尋常型、副腫瘤型和落葉型天皰瘡)血清對(duì)HaCaT細(xì)胞橋粒芯糖蛋白1、3(DSG1、3)及mRNA表達(dá)的影響。方法: 采集3例患者血清，ELISA測(cè)定抗DSG1抗體和抗DSG3抗體；血清培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，直接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面DSG1、3熒光強(qiáng)度，qPCR測(cè)定DSG3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: 尋常型天皰瘡患者血清抗DSG1抗體及抗DSG3抗體均陽(yáng)性，副腫瘤型天皰瘡患者血清抗DSG3抗體陽(yáng)性，落葉型天皰瘡患者血清抗DSG1抗體陽(yáng)性。3例患者血清分別作用后，HaCaT細(xì)胞表面DSG3熒光強(qiáng)度均降低；尋常型及副腫瘤型天皰瘡患者血清作用后，HaCaT細(xì)胞DSG3 mRNA表達(dá)增加，落葉型天皰瘡患者血清作用后，HaCaT細(xì)胞DSG3 mRNA表達(dá)降低。結(jié)論:抗DSG1抗體血清可以降低DSG3表達(dá)；抗DSG3抗體血清可以增加細(xì)胞中DSG3的表達(dá)，但血清中的抗DSG3抗體存在以及KC細(xì)胞對(duì)DSG3的內(nèi)吞等作用會(huì)將其表達(dá)的蛋白減少。

HaCaT細(xì)胞； 橋粒芯糖蛋白3； 天皰瘡

天皰瘡是已被公認(rèn)的抗鈣黏素自身免疫性疾病。該病的發(fā)生與機(jī)體產(chǎn)生致病性抗橋粒芯糖蛋白(Desmoglein，DSG)1及抗DSG3為代表的抗橋粒成分自身抗體有關(guān)。目前已研究顯示不同DSG抗體可以導(dǎo)致臨床不同類型天皰瘡，如自身抗原為DSG1有天皰瘡與流行性落葉型天皰瘡；自身抗原為DSG3黏膜主導(dǎo)型尋常型天皰瘡；自身抗原為DSG1與DSG3的有黏膜皮膚型尋常型天皰瘡、藥物誘導(dǎo)天皰瘡及副腫瘤天皰瘡。目前DSG補(bǔ)償及空間效應(yīng)理論即DSG途徑被大多數(shù)研究者認(rèn)可，DSG補(bǔ)償理論認(rèn)為同一細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)的DSG1、DSG3可以互相補(bǔ)償對(duì)方的功

能不足，空間效應(yīng)理論認(rèn)為自身抗體與DSG(主要為N端)結(jié)合所致空間效應(yīng)阻礙細(xì)胞間DSG黏附作用。但是這兩種理論是如何引起角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte，KC)出現(xiàn)棘層松解的病理生理學(xué)機(jī)制，目前并沒(méi)有詳細(xì)的闡述。為探討抗DSG1抗體及抗DSG3抗體對(duì)KC的影響，我們進(jìn)行如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清與細(xì)胞來(lái)源 本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)患者及正常對(duì)照簽署知情同意書(shū)后采集血液標(biāo)本。所采集的患者符合天皰瘡臨床診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床表現(xiàn)為皮膚或黏膜有松弛性水皰；(2)皮膚組織病理學(xué)改變?yōu)楸砥?nèi)水皰；(3)皮膚活檢直接免疫熒光結(jié)果為免疫球蛋白(Ig)G在表皮內(nèi)呈網(wǎng)狀沉積，同時(shí)滿足(4)；(4)未經(jīng)系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療。正常對(duì)照取自于未患皮膚疾病的正常成人。實(shí)驗(yàn)涉及的HaCat細(xì)胞系源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司及美國(guó)Life Technologies公司?？笵SG1、3自身抗體 ELISA試劑盒購(gòu)于日本MBL公司。DSG3一抗購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司。FITC標(biāo)記二抗均購(gòu)于美國(guó)Jackson公司。FluoViewTMFV1000激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。RNA提取試劑TRIzol購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。qPCR試劑盒購(gòu)于普洛麥格生物技術(shù)有限公司。qPCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 qPCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 血清采集及血清抗體滴度測(cè)定 取患者及正常成人上肢靜脈血20 mL，靜置4℃冰箱2 h后，4℃低溫離心機(jī) ×300 g離心 10 min；ELISA法應(yīng)用抗DSG1、抗DSG3自身抗體測(cè)定試劑盒測(cè)定不同患者血清中抗DSG1、抗DSG3抗體滴度。

1.2.2 HaCaT細(xì)胞系的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮容器中取出HaCaT細(xì)胞凍存管，迅速置于37℃水浴鍋中，并不時(shí)搖動(dòng)并變換位置，使凍存管中的凍存物在1 min之內(nèi)融化。融化后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到離心管，1000 rpm (×179 g)離心4 min，棄去上清液。10%胎牛血清－DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。次晨更換一次培養(yǎng)液，并觀察生長(zhǎng)情況；繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.3 天皰瘡患者血清培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)至80%滿時(shí)傳代，待細(xì)胞融合50%～60%，加入PBS清洗細(xì)胞后更換為含50%不同來(lái)源患者血清的DMEM培養(yǎng)基，正常對(duì)照以含50%正常血清的DMEM培養(yǎng)基代替。24 h后，倒置顯微鏡下觀察HaCaT細(xì)胞集落形成與集落融合的情況并進(jìn)行直接免疫熒光染色。

1.2.4 直接免疫熒光測(cè)定HaCaT表面DSG3表達(dá)取出1.2.3步培養(yǎng)后HaCaT細(xì)胞爬片，加入新鮮配制的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。PBS清洗3遍，每次5 min。加入2%牛血清白蛋白PBS封閉30 min。加入抗DSG3抗體室溫孵育1 h；加入二抗后室溫孵育45 min；加入7.5 μg/mL Hoechest33342染色10 min標(biāo)記細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡下觀察DSG3蛋白熒光強(qiáng)度?？瞻讓?duì)照以PBS代替一抗，余操作同。

1.2.5 qPCR測(cè)定HaCaT細(xì)胞DSG3 mRNA表達(dá)TRIzol法提取RNA，蛋白核酸分析儀測(cè)定RNA濃度，要求A260/280 nm值為1.7～2.0。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核苷酸(cDNA)；依據(jù)qPCR試劑盒說(shuō)明qPCR擴(kuò)增目的條帶(表1)。

1.3 圖像采集及數(shù)據(jù)處理與分析 采用Thermal cycler’s軟件包計(jì)算的Ct值用來(lái)分析熒光強(qiáng)度。2－Ct代表相應(yīng)的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)以SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 ˉx±s統(tǒng)計(jì)描述，以O(shè)ne－Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖以 GraphPad Prism 5繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同亞型天皰瘡患者血清抗 DSG1抗體、抗DSG3抗體滴度測(cè)定 本研究共收集3例患者血清標(biāo)本，均符合天皰瘡臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)且未經(jīng)系統(tǒng)治療。3例患者為2女1男，患者A 45歲，病史8年，臨床診斷為尋常型天皰瘡，就診時(shí)皮損主要位于口腔，軀干散在少量?；颊連為15歲，病史15天，臨床診斷為副腫瘤天皰瘡(具體腫瘤不詳)，皮損主要累及口腔及四肢，軀干散在?；颊逤 62歲，病史1年，臨床診斷為落葉性天皰瘡，皮損主要表現(xiàn)為全身反復(fù)紅斑水皰、糜爛、結(jié)痂、脫屑。正常對(duì)照為29歲健康女性。收集3例患者及正常對(duì)照血清后，以ELISA法測(cè)定血清中抗DSG1、抗DSG3抗體滴度，結(jié)果顯示患者A血清抗DSG1抗體及抗DSG3抗體均陽(yáng)性，患者B血清抗DSG3抗體陽(yáng)性，患者C血清抗DSG1抗體陽(yáng)性，對(duì)照血清抗DSG1抗體及抗DSG3抗體均陰性(表2)。

表2 不同血清中抗DSG1抗體、DSG3抗體滴度

2.2 天皰瘡患者血清對(duì)HaCat細(xì)胞集落形成的影響

為研究含有不同抗體的患者血清對(duì)HaCaT細(xì)胞的集落形成的影響。對(duì)照組顯示，血清作用前后，未見(jiàn)集落形態(tài)明顯變化，細(xì)胞集落周圍分界不明顯，細(xì)胞邊界不清晰，集落間融合連續(xù)?；颊哐遄饔?4 h組，均出現(xiàn)細(xì)胞集落“收縮”，集落間分界明顯，集落邊緣清晰、融合不連續(xù)。不同血清影響下的HaCaT細(xì)胞形態(tài)差異不明顯(圖1)。

圖1 不同亞型天皰瘡患者血清作用24 h對(duì)HaCaT細(xì)胞集落形成的影響

2.3 不同亞型天皰瘡患者血清影響HaCaT細(xì)胞表面DSG3表達(dá) 為觀察不同亞型天皰瘡患者血清對(duì)HaCaT細(xì)胞 DSG3的影響，血清作用后，DIF測(cè)定DSG3熒光強(qiáng)度改變情況。圖2所示，應(yīng)用A、B、C及對(duì)照血清與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，免疫熒光顯示對(duì)照組中細(xì)胞體DSG3熒光強(qiáng)度高，尤其在細(xì)胞連接處最高。而A患者血清作用后HaCaT細(xì)胞出現(xiàn)胞體部DSG3熒光弱陽(yáng)性，連接處熒光強(qiáng)度較對(duì)照組降低。B患者血清與細(xì)胞共培養(yǎng)后，HaCaT細(xì)胞表面DSG3熒光呈陽(yáng)性，部分細(xì)胞連接處強(qiáng)陽(yáng)性熒光；C患者血清與細(xì)胞共培養(yǎng)后，HaCaT細(xì)胞表面DSG3熒光亦呈陽(yáng)性，平均熒光強(qiáng)度高于B患者血清處理后細(xì)胞，但未見(jiàn)局部強(qiáng)陽(yáng)性熒光。

2.4 不同亞型天皰瘡患者血清影響 HaCaT細(xì)胞DSG3 mRNA表達(dá) 血清共培養(yǎng)作用后，以qPCR測(cè)定各組DSG3 mRNA改變情況，結(jié)果組間出現(xiàn)明顯差

異(P＜0.01)。如表3及圖3所示，A患者血清與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)后DSG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組高152.7%，B患者血清作用后高172.9%，C患者血清作用后則降低為33.9%；A、B患者血清作用后出現(xiàn)的DSG3 mRNA增高具有顯著意義(P＜0.01)。C患者血清作用后的DSG3 mRNA降低較對(duì)照組及A、B兩組均出現(xiàn)顯著差異(P＜0.01)。

圖2 不同亞型天皰瘡患者血清作用24 h后HaCaT細(xì)胞表面DSG3表達(dá)

圖3 不同亞型天皰瘡患者血清與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)后DSG3 mRNA表達(dá)

表3 不同亞型天皰瘡患者血清與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)后DSG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)含抗DSG3抗體的尋常型及副腫瘤型天皰瘡患者血清可以降低KC DSG3熒光強(qiáng)度，這一結(jié)果和Lanza等1研究相似，他們發(fā)現(xiàn)抗體量達(dá)到l mg/mL可以導(dǎo)致DSG3表達(dá)量降低及棘層松解的形成，但本研究由于部分限制并未嚴(yán)格定量。這種熒光強(qiáng)度的降低可能與自身抗DSG3抗體與KC表面抗原位點(diǎn)結(jié)合后阻礙外源抗體結(jié)合2有關(guān)，還有可能與自身抗DSG3抗體優(yōu)先與成熟DSG3結(jié)合3有關(guān)，上述反應(yīng)的結(jié)果即表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)中種屬特異性一抗及熒光二抗的結(jié)合量降低。造成KC表面DSG3熒光強(qiáng)度降低這一結(jié)果，還有可能是自身抗DSG3抗體與KC結(jié)合后導(dǎo)致KC表面DSG3的快速枯竭所致。研究發(fā)現(xiàn)，抗DSG3自身抗體結(jié)合KC表面DSG3后，可以通過(guò)介導(dǎo)KC對(duì)DSG內(nèi)吞4使得KC細(xì)胞表面DSG3快速枯竭，而p38 MAPK途徑的激活參與可這種KC內(nèi)吞作用，5因?yàn)橐种芇38可以阻止自身抗DSG3抗體介導(dǎo)的KC內(nèi)吞過(guò)程。4還有研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格動(dòng)力系統(tǒng)所誘導(dǎo)的KC細(xì)胞骨架重組6也可以直接參與內(nèi)吞過(guò)程。DSG3抗體的快速枯竭原因之二可能與DSG3在自身抗體作用后的裂解7及易溶解有關(guān)，而這一途徑也通過(guò)MAPK通路參與。4也有研究者認(rèn)為蛋白激酶C(PKC)也參與影響DSG3表達(dá)，PKC的參與可能是通過(guò)鈣誘導(dǎo)PKC介導(dǎo)的KC的分化8以及PKC同工酶的差異表達(dá)所致黏附分子的分化依賴性差異表達(dá)有關(guān)。9抗DSG3抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程也有可能導(dǎo)致DSG3降低，因?yàn)榭笵SG3抗體促進(jìn)procaspase－3、Bax、Bcl－2、uPAR，白細(xì)胞介素－1β、白細(xì)胞介素－6及腫瘤壞死因子－α等細(xì)胞凋亡及大量炎癥因子釋放，2而細(xì)胞凋亡過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶9可以參與DSG3降低。10另外天皰瘡抗體黏附所致蛋白相關(guān)蛋

白酶敏感性增加，也可能與細(xì)胞表面的DSG3表達(dá)量降低相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)抗DSG1血清作用可以降低DSG3的可識(shí)別含量，這一結(jié)果與Schulze等11結(jié)果相同?？笵SG1抗體可能通過(guò)可以交叉識(shí)別DSG312從而覆蓋抗原表位并誘導(dǎo)DSG3的細(xì)胞內(nèi)吞作用和/或激活p38MAPK13參與DSG3內(nèi)化等有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)抗DSG1抗體血清可以降低DSG3 mRNA、抗DSG3抗體的血清可以增加DSG3 mRNA表達(dá)，這一作用可能機(jī)制有:(1)KC的負(fù)反饋?zhàn)饔茫?2)抗DSG1抗體觸發(fā)PKC信號(hào)通路變化14－16引起DSG3 mRNA表達(dá)降低；(3)或者與患者血清中存在其他抗體激活了相關(guān)通路有關(guān)。

綜上所述，抗DSG1抗體血清(落葉型天皰瘡患者血清)可以在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平降低DSG3表達(dá)；含抗DSG3抗體血清(尋常型天皰瘡及副腫瘤型天皰瘡)可以在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平增加DSG3表達(dá)，但抗DSG3抗體所致的蛋白翻譯的增加會(huì)被血清中的的抗DSG3抗體以及KC細(xì)胞對(duì)DSG3內(nèi)吞等作用所消耗或抵消。需要指出的是，由于副腫瘤天皰瘡(如患者B)一類患者體內(nèi)往往有針對(duì)多種自身抗體，且抗體類型除IgG外，還包括IgA、IgM等，但因本研究的時(shí)間及技術(shù)限制，未能將血清中的各種亞型及亞類自身抗體進(jìn)行分離，此為本研究之局限所在，下一步將展開(kāi)詳細(xì)研究。

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(收稿:2014－08－01 修回:2014－09－25)

Effects of serum from different subtypes of pemphigus on the expression of desmoglein－3 in HaCaT cells

LI Hui，LIN Lin，ZHANG Jie-chen，et al.Institute of Dermatology，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effects of serum from 3 patients with different subtypes of pemphigus(pemphigus vulgaris，pemphigus foliaceus and paraneoplastic pemphigus)on the expression of desmoglein－3 and mRNA in HaCaT cells.Methods:The levels of anti－DSG1 and anti－DSG3 autoantibodies from patients’serum were detected by ELISA.HaCaT cells were cultured in serum－DMEM culture.The content of DSG3 protein on HaCaT cells were detected by direct immunofluorescence and DSG3 mRNA were detected by qPCR.Results:ELISA showed positive of anti－DSG1 and anti－DSG3 autoantibodies in the patient with pemphigus vulgaris，positive of anti－DSG3 autoantibodies in the patient with paraneoplastic pemphigus and positive of anti－DSG1 autoantibodies in the patient with pemphigus foliaceus.The fluorescence intensity of DSG3 on the surface of HaCaT cells was decreased in the three patients after separately cultured with the sera of the three patients.The content of DSG3 mRNA in HaCaT cells was increased after cultured with serum of the patients with pemphigus vulgaris and paraneoplastic pemphigus.The content of DSG3 mRNA in HaCaT cells was decreased after cultured with serum of the patient with pemphigus foliaceus.Conclusion:The serum containing anti－DSG1 antibodies decreased the expression of DSG3 mRNA.The serum containing anti－DSG3 antibodies increased the expression of DSG3 mRNA but the protein of DSG3 was decreased because of the endocytosis of keratinocytes and existence of anti－DSG3 antibodies in the serum.

HaCaT cells；desmoglein 3；pemphigus

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81071295)衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(編號(hào):201002016)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年科研基金(編號(hào):2012J13)

1北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院＆中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042 2北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳，518000

?通信作者