丁香酚吸嗅對(duì)自閉癥大鼠社交行為的影響

桑婷婷，高曉平，李光武，阮 元

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)運(yùn)動(dòng)科，安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物研究所，安徽合肥 230032)

自閉癥，又稱孤獨(dú)癥，是以社會(huì)交往障礙和局限性、刻板性、重復(fù)性行為為主要特征，是廣泛性發(fā)育障礙中最有代表性的疾病之一［1］，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。其中社會(huì)交往障礙也是自閉癥患者達(dá)到最終康復(fù)目標(biāo)回歸社會(huì)的最大阻礙，目前暫無針對(duì)性的有效藥物。丁香酚精油是由丁香中提取，為其主要活性成分，是一種抗氧化劑，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗抑郁［2］、改善認(rèn)知［3］等功效。本研究通過觀察丁香酚精油通過嗅覺通路對(duì)丙戊酸鈉(VPA)自閉癥模型鼠社交行為的影響，從而進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 自閉癥模型制備及評(píng)定 健康成年清潔級(jí)Sprague-Dawy(SD)雄性(280～300 g)、雌性(220～250 g)大鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，充足水和食物飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周，依據(jù)文獻(xiàn)［4］的造模方法，按雌雄比2∶1于下午5時(shí)合籠，次日早晨8時(shí)行陰道涂片檢查是否存在精子，存在時(shí)記錄為妊娠第1天(E1)，孕鼠分籠飼養(yǎng)，于E12.5 d時(shí)給予模型組孕鼠腹腔注射 (VPA)600 mg·kg－1(用生理鹽水配成250 g·L－1溶液);對(duì)照組給予等量生理鹽水(NS)注射。模型組及鹽水對(duì)照組孕鼠產(chǎn)下仔鼠分別記為 VPA組、NS組;以出生當(dāng)天為生后第1天(P1)。記錄自閉癥模型組及對(duì)照組發(fā)育學(xué)情況:P7，P14，P21體重、P12～16睜眼時(shí)間，P8、P10、P12、P16 游泳能力及 P7 ～10 趨向能力等行為表現(xiàn)，21 d斷奶后適應(yīng)飼養(yǎng)1周，采用社交實(shí)驗(yàn)中社交次數(shù)和持續(xù)時(shí)間的記錄評(píng)估各組鼠社交情況。參照Schneider［5］，評(píng)估發(fā)育學(xué)及行為學(xué)確定造模是否成功。

1.2 社交行為 一個(gè)60 cm×40 cm×40 cm的黑色木箱，置于安靜的環(huán)境內(nèi)，用40 W紅光照明，分別對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠進(jìn)行檢測(cè)，要求參與測(cè)試的兩只鼠來自同一組，不同飼養(yǎng)箱，月齡、性別相同，體質(zhì)量差距控制在15 g內(nèi)，觀察10 min，記錄社交行為次數(shù)包括跟隨、追逐同伴、嗅生殖器、打斗、趴在鼠身上及頭—頭接觸等發(fā)生次數(shù)及持續(xù)時(shí)間，為減少對(duì)新環(huán)境的不適，實(shí)驗(yàn)鼠在實(shí)驗(yàn)前2 d放置于檢測(cè)籠內(nèi)5 min適應(yīng)，每天2次;為了激發(fā)出更多的社交行為，測(cè)試前1 d單獨(dú)隔離至少3.5 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)方式 選擇成功造模的自閉癥模型鼠20只，隨機(jī)分為模型吸嗅組(VPA-E)和模型對(duì)照組(VPA-C)。吸嗅方法參考文獻(xiàn)［6］，丁香酚溶劑均勻地灑在密閉的實(shí)驗(yàn)盒底部，上面放置一帶有許多孔的薄鐵欄柵。給藥時(shí)，首先使精油充分揮發(fā)，彌漫整個(gè)實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)，后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入，蓋上盒蓋，吸嗅30 min后取出動(dòng)物，每天3次，共持續(xù)4周。丁香酚、蒸餾水以1∶999濃度配置，吸嗅組給予稀釋后丁香酚精油(安徽醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物研究所提供)吸嗅，對(duì)照組吸嗅清潔空氣。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間不同時(shí)間點(diǎn)定量數(shù)據(jù)的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析方法，多組間采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)的方法，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 發(fā)育及行為表現(xiàn)情況

2.1.1 發(fā)育情況 與NS組相比，VPA組鼠表現(xiàn)為各時(shí)間點(diǎn)低體重，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P7［(11.29±1.48)g vs(9.92 ±1.26)g］、P14［(20.71 ±3.05)g vs(13.87 ± 1.86)g］、P21［(37.9 ± 4.88)g vs(30.8 ±2.39)g］，睜眼時(shí)間延遲，P12 天兩組仔鼠均未睜眼，P13～15自閉癥模型組的睜眼情況評(píng)分均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P13［(0.00±0.00)分 vs(0.41 ±0.69)分］、P14［(0.45 ±0.69)分 vs(1.18 ±0.60)分］、P15［(1.18 ±0.75)分 vs(2.00 ±0.00)分］，P16 時(shí)兩組仔鼠雙眼均已睜眼。

2.1.2 行為表現(xiàn) VPA組趨向能力實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)身所用時(shí)間較NS組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P7［(27.09 ±3.96)s vs(18.18 ±3.03)s］、P8［(23.3±5.20)s vs(13.18 ± 2.40)s］、P9［(17.18 ±3.573)s vs(8.6 ±1.80)s］、P10［(14.91 ±3.42)s vs(6.82 ±1.40)s］;游泳能力評(píng)分低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P8［(1.09 ±0.70)分 vs(2.27 ±0.65)分］、P12［(2.45 ±0.52)分 vs(3.45 ±0.52)分］，P10、P16天兩組仔鼠游泳能力無差異;社交試驗(yàn)中P28天VPA組仔鼠在接觸次數(shù)及持續(xù)時(shí)間上均低于 NS組，P ＜0.05，接觸次數(shù)［(35.75 ±3.31)次 vs(19.58 ±4.87)次］、持續(xù)時(shí)間［(64.42 ±6.02)s vs(35.58 ±8.12)s］。

2.2 精油吸嗅后社交行為的變化情況 與NS組相比，VPA-C組接觸次數(shù)減少明顯，接觸持續(xù)時(shí)間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與VPA-C組相比，VPA-E組接觸次數(shù)增加，持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，P ＜0.05。結(jié)果見表1，2。

表1 各組大鼠社交行為中接觸次數(shù)的比較(±s，次)

表1 各組大鼠社交行為中接觸次數(shù)的比較(±s，次)

注:與 VPA-C 組相比，#P ＜0.05;與 VPA-E 組比較，※P ＜0.05。

組別 N 干預(yù)后NS 10 55.41 ±3.23#※VPA-E 10 46.92 ±4.72#VPA-C 10 33.17 ±4.86

表2 各組大鼠社交行為中接觸持續(xù)時(shí)間的比較(±s，s)

表2 各組大鼠社交行為中接觸持續(xù)時(shí)間的比較(±s，s)

注:與 VPA-C 組相比，#P ＜0.05;與 VPA-E 組比較，※P ＜0.05。

組別 N 干預(yù)后NS 10 91.00 ±5.41#※VPA-E 10 82.83 ±5.89#VPA-C 10 61.08 ±9.10

3 討論

丙戊酸鈉是目前使用最廣泛的一種抗癲癇藥物，在雙向情感障礙及偏頭痛的治療中也有涉及。然而，VPA也是一種已知的致畸藥物，孕期尤其是器官形成期使用可引起胎兒神經(jīng)發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、行為問題和交流的障礙［7］。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)在胎鼠的神經(jīng)管閉合時(shí)間內(nèi)給予孕鼠單VPA干預(yù)可引起仔鼠發(fā)育及行為學(xué)異常，這與自閉癥患者臨床表現(xiàn)相近。本研究參照Schneider等［4］造模方法制備自閉癥動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型鼠存在明顯的發(fā)育學(xué)及行為學(xué)異常。與NS組相比，VPA組表現(xiàn)為低體重，睜眼時(shí)間延遲，游泳能力評(píng)分低水平，趨向?qū)嶒?yàn)中轉(zhuǎn)身所用時(shí)間明顯延長(zhǎng)，社交實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為接觸次數(shù)的減少及持續(xù)時(shí)間縮短。與崔利軍等［8］的研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)自閉癥模型制備成功，證實(shí)VPA動(dòng)物模型具有重復(fù)性好、良好的表面效度。

嗅覺是最原始的感覺之一，參與生物多種行為，如覓食、交流、情感等，其通路在腦內(nèi)投射范圍廣泛。氣味分子與嗅上皮的特異性G蛋白偶聯(lián)受體神經(jīng)元結(jié)合產(chǎn)生動(dòng)作電位，沿軸突傳遞至嗅球，經(jīng)嗅覺通路到達(dá)情緒相關(guān)中樞下丘腦、杏仁核等［9］，產(chǎn)生對(duì)氣味的感受。杏仁核在社會(huì)行為和調(diào)整情緒中有著重要的作用，其相關(guān)結(jié)構(gòu)的功能紊亂可能參與自閉癥的神經(jīng)病理學(xué)［10］。研究表明芳香類物質(zhì)可通過嗅覺通路，調(diào)節(jié)自主神經(jīng)及生理功能［11］;影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量緩解抑郁樣癥狀［2，12］、改善空間學(xué)習(xí)記憶能力［3］等。所以我們推測(cè)芳香物質(zhì)可通過嗅覺通路改善自閉癥的社交行為。本研究以VPA腹腔注射建立自閉癥模型，使用丁香酚吸嗅干預(yù)VPA大鼠，發(fā)現(xiàn)丁香酚吸嗅組社交實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯優(yōu)于模型組，說明丁香酚吸嗅對(duì)VPA大鼠的社交障礙有一定的治療作用。

5－羥色胺(5-HT)作為人類大腦系統(tǒng)最早開發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在腦內(nèi)分布廣泛，其神經(jīng)元胞體多數(shù)位于中縫核群，其中起自中縫背核與中縫正中核的纖維，向上投射到下丘腦、杏仁體、海馬等腦區(qū)。臨床研究發(fā)現(xiàn)約1/3自閉癥患者在發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期存在高5-HT血癥［13］，因幼兒早期血腦屏障系統(tǒng)不完善，高水平5-HT可進(jìn)入腦內(nèi)［14］，通過負(fù)反饋?zhàn)饔靡种谱陨砩窠?jīng)元的發(fā)展和靶器官的發(fā)育［15］。因此5-HT系統(tǒng)發(fā)育異?？赡芘c自閉癥患者腦發(fā)育異常有關(guān)［16］。動(dòng)物研究中發(fā)育早期使用血清素受體激動(dòng)，幼崽表現(xiàn)出“孤獨(dú)癥樣”行為，如社交障礙和刻板重復(fù)行為等［17］。非典型抗精神病藥可改善自閉癥刻板、社交障礙等行為［18］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)VPA自閉癥模型存在社會(huì)交往障礙，早期丁香酚吸嗅干預(yù)后社交行為有所改善，推測(cè)丁香酚通過嗅覺通路調(diào)節(jié)腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，影響靶器官杏仁核及其相關(guān)結(jié)構(gòu)的發(fā)育，從而改善社交行為。

綜述所述，丁香酚精油吸嗅可一定程度上改善VPA自閉癥大鼠社交障礙，其具體可能的作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。

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