仙鶴草中鶴草酚的提取及分離純化研究

姜曉姝，金宏波，白淑芝，劉曉濱

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)1.機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心;2.病理生理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150081;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤放療科，黑龍江哈爾濱 150086)

仙鶴草(Agrimonia Pilosa Ledeb)，為薔薇科多年生草本植物龍牙草的全草，又名脫力草、龍牙草、狼牙草、黃龍草等，在中國(guó)大部分地區(qū)均有分布。仙鶴草中含有揮發(fā)油、微量元素、仙鶴草素、仙鶴草內(nèi)脂、鞣質(zhì)、甾醇、有機(jī)酸、酚類化合物和糖苷類等化合物［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，鶴草酚具有抗腫瘤極其顯著的放射增敏作用［2－4］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者嘗試用不同的方法對(duì)鶴草酚的提取、含量測(cè)定等進(jìn)行了一些研究。本實(shí)驗(yàn)在總結(jié)前人各種提取、測(cè)定方法［5－9］優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新運(yùn)用超聲波法對(duì)仙鶴草中鶴草酚進(jìn)行粗提，并結(jié)合兩相溶劑萃取法和酸堿分離法，對(duì)鶴草酚分離純化進(jìn)行研究，具有快速、簡(jiǎn)便、回收率高的特點(diǎn)，希望本研究所建立的測(cè)定方法能為仙鶴草酚的定量研究以及開(kāi)發(fā)利用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 仙鶴草購(gòu)于哈爾濱世一堂大藥房;鶴草酚對(duì)照品(純度:68.71%，黑龍江省衛(wèi)生學(xué)校植化室自制，經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)分析中心、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)和黑龍江省藥檢所聯(lián)合測(cè)定);無(wú)水乙醇、石油醚、氯仿等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV－2100、上海尤尼柯、上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司);高效液相色譜儀(LC－20A、島津、日本);薄層層析硅膠板(G型、50 mm×100 mm、青島裕民源硅膠試劑廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鶴草酚的提取、分離純化 精確稱取仙鶴草經(jīng)粉碎至20目的樣品，在一定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、物料配比、時(shí)間、溫度下進(jìn)行超聲提取。一次超聲提取的濾液經(jīng)二次超聲提取，二次的濾液進(jìn)行三次提取，三次提取的濾液用于重新加料時(shí)的一次提取的提取液。一次、二次濾液為超聲提取的提取物，合并后濃縮至一定體積，加無(wú)水乙醇定容至100 mL，進(jìn)行分析測(cè)定。

將仙鶴草提取物1 g，溶于20 mL乙酸乙酯中，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入10 mL 5%Na2CO3反復(fù)振搖、靜置，分出下層液Na2CO3相，如此萃取2次;然后向分液漏斗中乙酸乙酯相加入10 mL 5%NaOH反復(fù)振搖、靜置，分出下層液NaOH;加入10%HCl至pH2時(shí)，析出淡黃色絮狀物;過(guò)濾，棄去溶液，沉淀用雙蒸水洗至中性，減壓干燥得鶴草酚粗晶;用5 mL氯仿溶解，過(guò)濾，將濾液室溫放置，揮發(fā)出三分之一體積的氯仿后加入石油醚5 mL，室溫放置，逐漸析出結(jié)晶，濾取結(jié)晶(黃綠色斜方棱晶)得純化物，用HPLC法經(jīng)面積歸一化計(jì)算鶴草酚的含量。

1.3.2 純化物的檢測(cè)分析 薄層層析鑒定:取經(jīng)純化獲得的純化物和對(duì)照品各5 mg，分別置于小試管中，各加氯仿5 mL溶解。用微量注射器各吸取5 μL，點(diǎn)于5 cm×10 cm的G硅膠板的點(diǎn)樣線上，豎直放入盛有展開(kāi)溶劑的密閉展析缸中，待溶劑上行約7.7 cm處時(shí)取出，迅速用鉛筆畫(huà)出溶劑的前沿線，待溶劑揮發(fā)干后，噴濃硫酸加熱顯色，在顯示顏色的斑點(diǎn)位置，用鉛筆輕輕標(biāo)記，測(cè)量并計(jì)算物質(zhì)所移動(dòng)的距離與溶劑前沿所移動(dòng)的距離的比值(即Rf值)。

紫外分光光度法鑒定:儀器工作條件為狹縫寬度5.0，測(cè)定波長(zhǎng)間隔0.2 nm，掃描速度為快速。取獲得的純化物(精品鶴草酚)5 mg，加無(wú)水乙醇溶解，并定容至50 mL，再稀釋到含量為4 mg·L－1，pH 7.5～8.0的溶液;同時(shí)配制對(duì)照品含量為4 mg·L－1溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～400 nm之間掃描，觀察其吸收?qǐng)D譜。

純化物中鶴草酚含量的測(cè)定:采用HPLC法，經(jīng)面積歸一化法計(jì)算鶴草酚的含量。色譜柱:島津C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇—水—三乙胺(58∶42∶0.2);流速:1.2 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):325 nm;柱溫:30℃。

對(duì)照品溶液制備:稱取鶴草酚對(duì)照品10 mg，用少量氯仿溶解后，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。吸取該溶液4 mL，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.04 g·L－1的鶴草酚對(duì)照品溶液。微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)取續(xù)濾液即可作為對(duì)照品溶液。

樣品溶液的制備:稱取鶴草酚純化物10 mg，用少量氯仿溶解后，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。吸取該溶液4 mL，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.04 g·mL－1的鶴草酚樣品溶液。微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)取續(xù)濾液即可作為對(duì)照品溶液。

樣品面積百分含量的計(jì)算:試樣中鶴草酚的峰面積百分含量Xi(%)按下式計(jì)算:

Xi=(Ai/∑Ai)×100%

Xi為試樣中鶴草酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù);Ai為試樣中組分I的峰面積。

2 結(jié)果

2.1 超聲波提取的工藝條件 超聲波提取工藝條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)為四因素三水平正交試驗(yàn)，各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交表頭L9(34)及結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析如下:(1)通過(guò)對(duì)極差的表觀分析得到:最優(yōu)工藝條件為:溶劑60%乙醇，液料比10∶1，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度70℃，提取收率為0.183%。(2)因本試驗(yàn)設(shè)計(jì)為飽和正交試驗(yàn)，為提高分析的靈敏度，特將液料比B的殘差平方和(其在各因素中最小)視作誤差項(xiàng)，據(jù)此對(duì)試驗(yàn)結(jié)果資料進(jìn)行方差分析。結(jié)果:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)因素P值最小(P≈0.05，接近顯著)，提示該因素可能是最重要的影響因素，其次分別為超聲時(shí)間，超聲溫度。

表1 正交因素表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.2 鶴草酚的純化 用60%乙醇超聲提取獲得的鶴草酚粗品，尚混雜有鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮等雜質(zhì)化合物。經(jīng)乙酸乙脂溶解濾去不溶物后，再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%碳酸鈉、5%氫氧化鈉溶液進(jìn)行溶液萃取，分出黃酮類及有機(jī)酸類物質(zhì)，得到鶴草酚富集液。鶴草酚富集液經(jīng)鹽酸沉淀處理、氯仿重結(jié)晶，得到高純度的鶴草酚結(jié)晶。

2.3 純化物的檢測(cè)

2.3.1 純化物的薄層層析 從圖1可以看出，純化物(樣品)和對(duì)照品(鶴草酚)均只有一個(gè)移動(dòng)斑點(diǎn)。展開(kāi)溶劑環(huán)已烷∶無(wú)水乙醇∶乙酸乙酯∶冰醋酸(25∶1∶5∶3)時(shí)溶劑的前沿線所移動(dòng)的距離為7.7 cm，對(duì)照品所移動(dòng)的距離為6.6 cm，純化物所移動(dòng)的距離為 6.6 cm，對(duì)照品 Rf標(biāo)=0.85，樣品Rf試=0.85。經(jīng)純化獲得的樣品和對(duì)照品鶴草酚的分子量相同，可初步證實(shí)本品為鶴草酚。

2.3.2 純化物的紫外分光光度法分析 純化物(鶴草酚)和對(duì)照品(鶴草酚)在波長(zhǎng)200～400 nm之間進(jìn)行掃描，在338 nm和346 nm顯現(xiàn)兩個(gè)高峰，274 nm處顯現(xiàn)一個(gè)高峰與對(duì)照品最大吸收的光譜圖相同(圖2)，說(shuō)明經(jīng)純化獲得的鶴草酚純品和對(duì)照品鶴草酚具有相同的組分。

2.3.3 純化物中鶴草酚的含量 經(jīng)HPLC法面積歸一化計(jì)算鶴草酚的含量為65.09%(圖3)

3 討論

天然多酚類物質(zhì)在植物中廣泛存在，不僅種類和數(shù)量繁多，而且存在的形式既復(fù)雜又多種多樣［10－12］。所以針對(duì)不同的天然物質(zhì)中的多酚，測(cè)定方法可以有多方面選擇，本實(shí)驗(yàn)以采用超聲波法提取的仙鶴草提取物為樣品，研究鶴草酚的分離純化方法。結(jié)果表明，采用兩相溶劑萃取法與酸堿分離法相結(jié)合，然后用氯仿重結(jié)晶法，使鶴草酚的純度達(dá)到65.09%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，選擇合適溶劑是結(jié)晶重結(jié)晶過(guò)程的關(guān)鍵。而溶劑的用量、降溫的速度是影響晶體形狀和純度的重要因素。

在對(duì)鶴草酚的定性及定量測(cè)定中采用了薄層層析法、紫外分光光度及高效液相色譜法，實(shí)驗(yàn)證明從仙鶴草中提取及分離純化鶴草酚的新工藝路線合理，分析方法準(zhǔn)確可靠，可以在實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

［1］路 芳，巴曉雨，何永志.仙鶴草的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2012，43(5):851 －855.

［2］劉曉濱，白淑芝，姜曉姝，等.鶴草酚對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)腫瘤，2012，21(11):848 －851.

［3］金在久.仙鶴草的化學(xué)成分及臨床研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21(5):468 －471.

［4］賀 成，秦文杰，唐曉晶，等.仙鶴草地上部分仙鶴草酚B的分離與鑒定［J］.中草藥，2011，42(2):255 －256.

［5］杜成智，王 卉，馮 旭，等.不同產(chǎn)地仙鶴草揮發(fā)油成分的GC －MS分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(4):253－255.

［6］李 倩，劉子衿，葉燕彬，等.分光光度法測(cè)定仙鶴草總酚含量的方法研究［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(1):107 －110.

［7］謝顯珍，王玉林，朱丹暉，等.氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合保留指數(shù)分析仙鶴草揮發(fā)性成分［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29(5):651－654.

［8］姚 振.仙鶴草內(nèi)生真菌活性菌株的分離篩選及其與宿主相互作用的研究［D］.杭州:浙江工業(yè)大學(xué)，2013.

［9］趙 亞.仙鶴草藥效學(xué)研究［D］.杭州:浙江工業(yè)大學(xué)，2011.

［10］費(fèi)鮮明，陳 艷，吳萬(wàn)飛，等.仙鶴草水提物體外對(duì)血小板聚集、凝血功能及血液流變學(xué)的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18(1):10 －16.

［11］王寶慶，金哲雄.仙鶴草的化學(xué)成分及抗氧化研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2011，10(2):167 －169.

［12］武曉丹，金哲雄，宛春雷，等.仙鶴草醋酸乙酯有效部位體外誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(2):119 －122.