沒藥甾酮對膽管癌RBE細胞移植瘤生長和miRNA表達譜的影響

仲 飛，童鑄廷，范璐璐，姚夢群，孫國平

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230022)

小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于動物和植物等多細胞生物中約22個核苷酸左右的非編碼單鏈小分子RNA，它們通過介導轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在生物許多重要的功能基因網(wǎng)絡中起著重要調(diào)控的作用［1］。沒藥為印度傳統(tǒng)草藥，數(shù)千年來被用作香料、食品、化妝品和藥品［2］。現(xiàn)代研究表明，沒藥甾酮(Guggulsterone)是沒藥中主要生物活性成分之一，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤、改善認知行為等［3］。但沒藥甾酮抗腫瘤機制是否涉及miRNA尚無報道，本研究觀察了沒藥甾酮對膽管癌RBE細胞株移植瘤生長的影響，同時利用基因芯片技術(shù)檢測沒藥甾酮對移植瘤miRNA表達譜的影響，篩選得到差異表達的miRNAs，深化了對沒藥甾酮抗腫瘤機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 21只6～7周齡健康雌性SD大鼠，質(zhì)量150～170 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(皖)2005－02。飼養(yǎng)于SPF動物實驗室。人膽管癌RBE細胞株購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。沒藥甾酮為美國Sigma公司產(chǎn)品。Trizol購自美國Invitrogen公司，GeneChip?miRNA芯片及試劑盒為美國Affymetrix公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 收集對數(shù)生長期的RBE細胞，PBS漂洗，RPMI1640培養(yǎng)基(不含血清)重懸細胞，調(diào)整細胞數(shù)至1 ×1010·L－1，每只 0.8 mL 右側(cè)后腿皮下注射，建立動物移植瘤模型。移植后72 h后，動物按完全隨機原則均分為3組:高劑量實驗組、低劑量實驗組與空白對照組。高、低劑量實驗組大鼠分別予 40、20 mg·kg－1·d－1沒藥甾酮，灌胃給藥，對照組大鼠灌胃給予等量生理鹽水。每5 d測量裸鼠質(zhì)量和腫瘤體積，處理30 d后取材。

1.2.2 腫瘤體積檢測 游標卡尺測量腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積，公式:V(cm3)=長徑×短徑2×0.5。

1.2.3 腫瘤組織總RNA的提取 高劑量實驗組和對照組每組取4只大鼠，每只鼠剪取腫瘤組織0.1 g，制備組織勻漿，進行標本混樣，Trizol試劑常規(guī)抽提總RNA。每個樣品取1 μL，雙蒸水稀釋200倍后用核酸蛋白定量儀測定RNA含量與純度，要求總RNA樣品的OD 260/280＞1.8，OD 260/230＞1.5。

1.2.4 miRNAs表達譜的檢測 使用 60 ～100 μg總RNA，miRNA Isolation Kit分離 miRNA，使用 Poly(A)聚合酶加尾，T4 RNA連接酶將其與帶生物素標記的信號分子連接、標記，后將miRNA溶于含25%甲酰胺的100 μL 6 ×SSPE 緩沖液(0.90 mol·L－1NaCl，60 mmol·L－1Na2HPO4，6 mmol·L－1EDTA，pH 6.8)進行雜交，于38℃與微陣列雜交過夜。雜交結(jié)束后，微陣列玻片于40℃下用2×SSC漂洗6 min，甩干后，GenePix 4000B雙通道激光掃描儀進行掃描，采用 SignificanceAnalysisofMicroarrays(SAM，version 2.1)軟件分析有統(tǒng)計學意義的差異表達位點。表達譜檢測由杭州聯(lián)川生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學處理 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。三組之間裸鼠質(zhì)量及腫瘤體積的不同時間點比較采用重復測量的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，兩組miRNA芯片結(jié)果采用t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 沒藥甾酮對裸鼠移植瘤生長的抑制作用 各組大鼠飼養(yǎng)期間生長狀態(tài)良好，移植瘤成瘤率100%，各組鼠間質(zhì)量差異無顯著性。沒藥甾酮高、低劑量實驗組腫瘤體積分別在處理20 d和25 d后顯著低于對照組，提示沒藥甾酮干預抑制了移植瘤生長;作用25 d和30 d后，高劑量組移植瘤體積顯著低于低劑量實驗組，說明沒藥甾酮抑瘤作用呈劑量依賴性，見圖1。

2.2 沒藥甾酮對移植瘤miRNA表達譜的影響高劑量實驗組和對照組移植瘤組織進行miRNAs表達譜的基因芯片檢測分析，結(jié)果表明兩組間表達水平具有顯著差異的miRNAs有18個，其中較對照組顯著上調(diào)的有11個，顯著下調(diào)的有7個。見表1。

表1 沒藥甾酮對移植瘤組織miRNAs表達的影響

3 討論

沒藥原產(chǎn)印度，為橄欖科植物沒藥樹樹干皮部滲出的油膠樹脂，作為藥用已有數(shù)千年歷史，很早就傳入我國，古代中醫(yī)典籍中對其多有記載。沒藥甾酮是沒藥中主要生物活性成分之一，具有多種藥理活性，近年來其抗腫瘤作用逐漸引起關注［4］。實驗證明，沒藥甾酮對多種腫瘤細胞有明顯的抑制增殖、誘導分化或凋亡、降低侵襲轉(zhuǎn)移等作用，其抗腫瘤機制涉及多條細胞內(nèi)分子信號通路，包括:Nrf2，NF-kB，STAT3，和 AP-1，MAPKs，PI3K/Akt等［4－10］。但是，這些機制相對分散，不同研究者的結(jié)果難以互相印證，因而有必要更深入的研究其抗腫瘤的關鍵機制，進而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點及療效預測指標，充分開發(fā)利用沒藥甾酮的抗腫瘤潛力。

研究表明，miRNA家族是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡中的關鍵因子，每個miRNA可能調(diào)控著數(shù)百個基因的表達，一個基因的表達又可能受多個miRNA的調(diào)控，提示miRNA可能以網(wǎng)絡的形式參與調(diào)控所有信號通路［1］，并有研究提示miRNA在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11－13］。那么miRNA在沒藥甾酮的抗腫瘤作用中發(fā)揮怎樣的作用呢?

本實驗首次報道了沒藥甾酮在體內(nèi)對膽管癌移植瘤有抑制作用，同時伴隨著miRNAs表達譜的改變，這提示沒藥甾酮可能通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達進而影響某些關鍵靶蛋白的活性從而起到抗瘤作用。我們初步分析了藥物處理前后腫瘤組織中表達水平具有顯著差異的18個miRNAs，發(fā)現(xiàn)其中某些miRNAs具有重要的生物學功能，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，例如:miRNA-21是一個明確的腫瘤相關基因［14］，其可以通過調(diào)節(jié)多條細胞信號轉(zhuǎn)導途徑來影響腫瘤的生物學行為，沒藥甾酮完全可能通過下調(diào)miRNA-21來發(fā)揮抗腫瘤作用。進一步的研究將采用實時定量PCR技術(shù)對表達差異明顯的miRNAs進行驗證，結(jié)合生物信息學與實驗生物學方法對miRNAs可能在沒藥甾酮抗膽管癌中作用進行深入探討。

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