寧夏回漢族KCNQ1基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究

劉 英，周 英，楊海燕，張海娜，謝曉敏，楊 澤

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院，上海 201300;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，寧夏銀川 750001;3.衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730)

2型糖尿病在中國是一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生問題，在我國成年人中的發(fā)病從1980年的1.0%增加到2001年的5.5%，發(fā)展非常迅速，最近報(bào)道我國糖尿病發(fā)病率已經(jīng)增加到9.7%［1］，人群具有較強(qiáng)的2型糖尿病遺傳易感性，因?yàn)樗鼈兏泻屯怀龅姆从吵隽朔逝终叩囊葝u素分泌異常。因此，中國可能代表亞洲人口確定2型糖尿病易感基因的很好的資源，在中國人群中進(jìn)行糖尿病易感基因的研究更具有意義。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。單核苷酸多態(tài)性的研究已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病，尤其是多基因遺傳性疾病易感基因的研究及精確定位中。Hiroyuki等［2］為首的日本研究小組，運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome－Wide Association Studies，GWAS)方法，發(fā)現(xiàn)了2型糖尿病新的易感基因 KCNQ1全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome－Wide Association Studies，GWAS)發(fā)現(xiàn)KCNQ1基因與T2DM和胰島素分泌受損相關(guān)，KCNQ1基因抑制通過阻斷鉀離子通道刺激胰島素分泌，KCNQ1可能發(fā)揮胰島素分泌的作用。近年來中國、韓國、日本、新加坡、丹麥發(fā)現(xiàn)KCNQ1多個(gè)單核苷酸多態(tài)性 (SNP)與2型糖尿病相關(guān)各個(gè)研究結(jié)果相一致，Rs231362位點(diǎn)在中國北方人中尚未見與T2DM的研究。隨著生活水平的提高，寧夏糖尿病患病率5%，居于全國前列［3］。寧夏是回族聚集區(qū)，有著特有飲食生活習(xí)慣，已成為寧夏地區(qū)的高發(fā)疾病之一 ，此時(shí)從分子水平對(duì)寧夏回族該病的遺傳背景進(jìn)行研究，探討這一地區(qū)回族和漢族KCNQ1基因rs231362的多態(tài)性與T2DM的關(guān)系，對(duì)少數(shù)民族糖尿病發(fā)病的病因及發(fā)病機(jī)制具有十分重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對(duì)照研究，在簽署知情同意的基礎(chǔ)上，在寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院共選取研究對(duì)象336例，其中病例組189例為2009—2010年住院病人，病例組為單獨(dú)2型糖尿病，單獨(dú)2型糖尿病定義為:判定標(biāo)準(zhǔn)按照世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年標(biāo)準(zhǔn)診斷。選擇空腹大于7.0 mmol·L－1且糖負(fù)荷后 120 min血糖大于11.1 mmol·L－1者作為病例組?？崭?12 h后，次晨行OGTT試驗(yàn)，口服75 g葡萄糖，分別于空腹及糖負(fù)荷后30、120 min采血，測(cè)定空腹及糖負(fù)荷30、120 min血糖、胰島素水平、空腹糖化血紅蛋白水平，所有人測(cè)定身高、體重、腰圍、臀圍，腰圍為平臍水平的周長，臀圍為臀部最寬處周長。排除胰腺炎病史、長期服用糖皮質(zhì)激素，排除糖尿病并發(fā)癥，并排除心、腦、腎疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤史，連續(xù)三代均為同一民族。病例組按民族分為:回族組96例，男52例，女44例，漢族組95例，男47例，女48例。對(duì)照組2009—2010年寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心健康者，在簽署知情同意的基礎(chǔ)上，既往無血糖異常史，排除胰腺炎病史、長期服用糖皮質(zhì)激素，排除糖尿病并發(fā)癥，并排除心、腦、腎疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤史，連續(xù)三代均為同一民族。健康體檢者146例，其中回族84例，男45例，女41例;漢族60例，男30例，女30例。正常組人群的民族、年齡、性別、身高、體重與2型糖尿病人群比較差異無顯著性(P ＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)指標(biāo) 患者臨床生化指標(biāo):膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FBG)、測(cè)餐后2 h血糖(2 hPG)。測(cè)量體重及身高計(jì)算腰臀比測(cè)量腰圍、臀圍、血壓，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。

1.2.2 基因提取及多態(tài)性分析 試劑盒(上海生工)提取 DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)多態(tài)性，應(yīng)用Primer－5軟件完成引物設(shè)計(jì)，PCR引物序列:上游引物 5＇TAC TGG CAA GTC CCT ATC CTT 3＇，下游引物 5＇ACA ACC TCA AAT CTC GGA ATG 3＇，PCR反應(yīng)體系:模板DNA 2μL、上下游引物各0.1μL、dNTP 0、2 μL、緩沖液 1 μL、Tag酶 0、2 μL、雙蒸水7.5μL。設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火57℃ 50 s，延伸72℃ 60 s，終末延伸限72℃ 10 min。共有36循環(huán)，再用限制性核酸內(nèi)切酶NlaⅢ酶切(上海生工)30℃(3～4 h)PCR產(chǎn)物，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，溴化乙錠(EB)染色，Gel DOC－2000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio－Rad公司生產(chǎn))顯像分析確定KCNQ1基因rs231362的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析均在SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件下完成，P＜0.05時(shí)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 樣本均衡性分析 本研究中病例組與對(duì)照組等位基因頻率分布比較，病例組和對(duì)照組基因型頻率符合哈丁溫伯格平衡(Hardy－Weinberg，HWE)，證明所選人群該位點(diǎn)的基因型分布具有群體代表性。

2.2 KCNQ1基因rs231362基因分型 用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLPPCR)，擴(kuò)增KCNQ1基因rs231362基因序列的DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NlaⅢ酶切后得到以下長度片段(見圖1)。TT 型:296bp、140 bp、125bp、23bp;TC 型:296 bp、163 bp、140 bp、125bp、23bp;CC 型:296 bp、163 bp、125bp。

2.3 病例組及糖耐量正常組在不同民族中KCNQ1基因rs231362多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率的表現(xiàn) KCNQ1基因rs231362多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在糖耐量正常組回族及漢族中差異均無顯著性，等位基因C的頻率在回族及漢族均較高，見表1。病例組與糖耐量正常組回族與漢族人群KCNQ1基因型及等位基因頻率間差異均無顯著性，兩組基因型頻率均以CC純合子多見，等位基因頻率以C為多見。見表2，3。

表1 糖耐量正常組組內(nèi)KCNQ1基因rs231362基因型和等位基因頻率的比較頻數(shù)/%

表2 2型糖尿病組及糖耐量正常組回族人群KCNQ1基因rs231362多態(tài)性分布頻數(shù)/%

表3 2型糖尿病組及糖耐量正常組漢族人群KCNQ1基因rs231362多態(tài)性分布頻數(shù)/%

2.4 KCNQ1基因rs231362位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病組各臨床生化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 KCNQ1基因rs231362多態(tài)性與2型糖尿病組回族及漢族人群TC、TG、LDL－C、SBP、NDP、FPG 水平無相關(guān)性，與低密度脂蛋白、腰臀比、BMI和腰圍可能有關(guān)聯(lián)。見表4。

表4 2型糖尿病組各臨床血液生物化學(xué)指標(biāo)與KCNQ1基因rs231362多態(tài)性的關(guān)系

3 討論

2型糖尿病是一種異質(zhì)性的慢性復(fù)雜遺傳疾病，主要由于胰島素抵抗和胰島素分泌缺乏共同作用所導(dǎo)致的血糖代謝障礙的常見代謝性疾病。全基因組掃描技術(shù)出現(xiàn)以來，與2型糖尿病遺傳易感性明確相關(guān)的候選基因到目前為止已經(jīng)達(dá)到19個(gè)，包括KCNQ1基因。從已發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)看，許多位點(diǎn)等位基因頻率存在種族差異，這決定這些基因在不同人群中的人群歸因風(fēng)險(xiǎn)性不同。KCNQ1基因全稱KQT樣電壓門控鉀通道家族成員1，位于11號(hào)染色體短壁11p15.5區(qū)域，該基因全長404120 bp，共包含16個(gè)外顯子，是一種編碼電壓門控鉀通道孔隙形成的亞單位(KvLQT1)，在心臟動(dòng)作電位復(fù)極以及上皮的水和鹽運(yùn)輸中起到重要的作用。KCNQ1基因突變會(huì)引起遺傳性長QT綜合征，羅馬沃德綜合征，耶偉爾和蘭格—尼爾森綜合征以及家族性心房顫動(dòng)。人類和動(dòng)物研究證實(shí)，KCNQ1基因突變可以導(dǎo)致鉀離子通道的功能障礙，導(dǎo)致心臟長QT間期綜合征，先天性耳聾，但是，KCNQ1基因在胰島細(xì)胞和培養(yǎng)的分泌胰島素的細(xì)胞中表達(dá)，KCNQ1基因抑制劑通過阻斷鉀離子通道刺激胰島素分泌［3－5］，這表明 KCNQ1 基因可能發(fā)揮調(diào)節(jié)胰島素分泌的作用。2型糖尿病易感變異基因的出現(xiàn)頻率與人種有關(guān)，而目前的研究主要以歐洲人為主，對(duì)其他種族的人群進(jìn)行基因相關(guān)性研究非常重要。KCNQ1基因是首次以亞洲人為對(duì)象確定的2型糖尿病的相關(guān)易感基因。不同于以往許多被發(fā)現(xiàn)的2型糖尿病基因在不同種群中的分布中有巨大差異，且不能得到一致重復(fù)驗(yàn)證，調(diào)查結(jié)果顯示，最近兩個(gè)獨(dú)立的東亞人群全基因組關(guān)聯(lián)研究［7－8］發(fā)現(xiàn)，一個(gè)位于KCNQ1基因15內(nèi)含子40 KB的SNPs與2型糖尿病和胰島素分泌損害持續(xù)相關(guān)。近年來，中國、韓國、日本、新加坡、以及丹麥做了大量關(guān)于KCNQ1基因的研究，發(fā)現(xiàn)KCNQ1的多個(gè)SNPs位點(diǎn)與2型糖尿病有關(guān)，各個(gè)研究基本一致［9－11］。但目前發(fā)現(xiàn)的2型糖尿病相關(guān)性最強(qiáng)位點(diǎn)位于非編碼區(qū)，是否在編碼區(qū)存在相關(guān)性更強(qiáng)的變異還不清楚，所以我們必須尋找潛在的基因突變，以及可能直接導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的致病突變，在本研究中，我們做了KCNQ1基因rs231362病例對(duì)照研究，已驗(yàn)證KCNQ1基因在寧夏回族和漢族中發(fā)病的作用。

本研究中結(jié)果表明KCNQ1基因rs231362位點(diǎn)，在寧夏地區(qū)回族與漢族糖耐量正常組中，基因型和等位基因頻率間無顯著性差異(P＞0.05)，提示KCNQ1基因rs231362多態(tài)性不存在民族差異。KCNQ1基因rs231362多態(tài)性在病例組中，回、漢族均以等位基因T多見，寧夏地區(qū)2型糖尿病發(fā)病率與T等位基因與無明顯關(guān)聯(lián)，攜帶CT/TT基因型者高于CC型者的中腰圍及體質(zhì)指數(shù)，提示該基因可能與腹型肥胖有關(guān)，與血脂代謝異常相關(guān)聯(lián)。綜上所述，KCNQ1與寧夏地區(qū)2型糖尿病無明顯關(guān)聯(lián)，雖然存在多種不確定因素，但考慮到不同種族和地區(qū)的人群的遺傳易感性的差異，以及2型糖尿病病因的高度異質(zhì)性，本研究尚存在不足之處，如樣本量仍不夠大，未考慮基因間相互作用，可能基因間之間的相互作用影響研究結(jié)果。在今后的研究中需要把握基因間的相互作用，基因與環(huán)境之間可能的相互作用等因素，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，由于2型糖尿病存在種族異質(zhì)性，不同種族研究結(jié)果存在差異，更為重要的是要開展候選基因的功能學(xué)研究，證明核苷酸多態(tài)性如何導(dǎo)致表型的改變，從而更深入地揭示2型糖尿病的遺傳學(xué)病因及發(fā)病機(jī)制。

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