有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏中毒對(duì)大鼠胰腺損害的實(shí)驗(yàn)研究

張慶龍，程景林，周 姝

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診內(nèi)科，安徽合肥 230601)

有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，據(jù)估計(jì)，全世界每年因 OPs造成的中毒事件超過3 000 000起，其中 220 000 人死亡［1］，我國每年約5～7萬人發(fā)生急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒，其病死率高達(dá)10%［2］。因此對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒機(jī)制的進(jìn)一步探討具有重要的臨床意義。國內(nèi)外有研究報(bào)道，急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒(AOPP)患者常合并胰腺損害［3－4］，我科在臨床實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)類似情況。目前關(guān)于AOPP致急性胰腺損害的報(bào)道多為回顧性分析，AOPP是否引起胰腺損害、中毒程度是否與胰腺損害存在正相關(guān)，無相關(guān)研究證據(jù)。本研究采用高毒性的敵敵畏經(jīng)口服給藥制作大鼠AOPP模型，監(jiān)測(cè)大鼠給藥后不同時(shí)間的血清膽堿酯酶、血清淀粉酶，觀察給藥24 h后胰腺病理改變，從而初步探討染毒大鼠胰腺損害發(fā)生情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)大鼠:安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)提供的清潔級(jí)雌性SD大鼠60只，月齡3個(gè)月，體重(250±20)g。合格證號(hào):34000200000101。

實(shí)驗(yàn)藥品:由山東大成農(nóng)藥有限公司提供的濃度為80%的敵敵畏原液。

實(shí)驗(yàn)試劑:由上海明豐生物科技有限公司提供的膽堿酯酶及淀粉酶的ELISA試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)喂飼，實(shí)驗(yàn)前12 h動(dòng)物禁食但不禁飲，可自由活動(dòng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組:玉米油對(duì)照組，敵敵畏低劑量實(shí)驗(yàn)組，敵敵畏高劑量實(shí)驗(yàn)組，每組各20只。

1.2.3 灌喂方法 對(duì)照組:分別灌喂玉米油2 mL。敵敵畏低劑量組:分別灌喂80%敵敵畏原液與玉米油按一定比例配制成的乳油2 mL，灌喂的農(nóng)藥劑量為8 mg·kg－1體重;敵敵畏高劑量組:分別灌喂80%敵敵畏原液與玉米油按一定比例配制成的乳油2 mL，灌喂的農(nóng)藥劑量為20 mg·kg－1體重。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè) 灌喂后6、24 h分別取大鼠內(nèi)眥動(dòng)脈血，以ELISA法測(cè)定血清膽堿酯酶、血清淀粉酶。

1.2.5 切片操作 給藥24 h后斷頭處死大鼠，迅速剖腹摘取胰腺頭部組織，放入10%甲醛中固定24 h，后石蠟固定，切片，HE染色。

1.2.6 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分 在光鏡下閱片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×200)，觀察胰腺組織病理學(xué)的變化，按照Schmidt等［5］標(biāo)準(zhǔn)從水腫、出血、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)4個(gè)方面評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀測(cè)資料均為計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。3組間的整體分析為單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清膽堿酯酶、淀粉酶變化

2.1.1 血清膽堿酯酶的比較 數(shù)據(jù)列于表1。染毒后各時(shí)點(diǎn)血清膽堿酯酶水平，3組間整體分析(單因素方差分析)，差異均顯著(P＜0.05)。再于各時(shí)相點(diǎn)處做3組間兩兩比較(LSD檢驗(yàn))，并結(jié)合數(shù)據(jù)來看:與對(duì)照組同時(shí)相點(diǎn)比較，低劑量組、高劑量組血清膽堿酯酶水平明顯降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與低劑量組同時(shí)相點(diǎn)比較，高劑量組膽堿酯酶下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 大鼠血清膽堿酯酶的比較(U·L－1，±s)

表1 大鼠血清膽堿酯酶的比較(U·L－1，±s)

組別 n 染毒后6 h 染毒后24 h A1:對(duì)照組20 866±178 692±184 A2:低劑量組 20 568±135 468±134 A3:高劑量組 20 465±110 304±118整體分析 F，P 41.796，0.000 34.758，0.000 A2 vs A1 LSD-t，P 6.547，0.000 4.799，0.000 A3 vs A1 LSD-t，P 8.800，0.000 8.304，0.000 A3 vs A2 LSD-t，P 2.254，0.028 3.505，0.001

2.1.2 血清淀粉酶的比較 數(shù)據(jù)列于表2。其變化規(guī)律如同前述膽堿酯酶:染毒后各時(shí)點(diǎn)血清淀粉水平，3組間單因素方差分析，差異均顯著(P＜0.05)。再于各時(shí)點(diǎn)處做3組間兩兩比較，并結(jié)合數(shù)據(jù)來看:與對(duì)照組同時(shí)相點(diǎn)比較，低劑量組、高劑量組血清淀粉酶水平明顯降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與低劑量組同時(shí)相點(diǎn)比較，高劑量組血清淀粉酶下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清淀粉酶的比較(U·L-1，±s)

表2 各組大鼠血清淀粉酶的比較(U·L-1，±s)

組別 n 染毒后6 h 染毒后12 h A1:對(duì)照組20 1 718±125 1 739±291 A2:低劑量組 20 1 971±157 2 248±341 A3:高劑量組 20 2 268±160 2 555±376整體分析 F，P 68.502，0.000 29.781，0.000 A2 vs A1 LSD-t，P 5.392，0.000 4.779，0.000 A3 vs A1 LSD-t，P 11.693，0.000 7.638，0.000 A3 vs A2 LSD-t，P 6.301，0.000 2.858，0.006

2.2 胰腺病理學(xué)觀察及評(píng)分

2.2.1 各胰腺組織HE切片的病理學(xué)觀察 對(duì)照組:大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，胰腺組織小葉間無水腫，無血細(xì)胞聚集，腺泡細(xì)胞無水腫及壞死，血管未見充血、出血，未見炎性細(xì)胞滲出(圖1);低劑量組:胰腺間質(zhì)內(nèi)充斥少量淡紅色水腫液，部分腺泡呈孤島狀，胰腺實(shí)質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張、充血、出血，可見灶性炎性滲出(圖2);高劑量組:鏡下表現(xiàn)與低劑量組大體相似，與低劑量組相比病變程度加重，部分切片邊緣組織細(xì)胞充血明顯(圖3)。

2.2.2 大鼠胰腺組織Schmidt J病理學(xué)評(píng)分 數(shù)據(jù)列于表3。整體分析知:大鼠胰腺組織Schmidt J病理學(xué)評(píng)分，三組間整體差異顯著(P＜0.05)。兩兩比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)來看:與對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組大鼠胰腺Schmidt J病理學(xué)評(píng)分明顯升高;與低劑量組比較，高劑量組評(píng)分更高。

表3 三組大鼠造模后病理組織學(xué)評(píng)分(±s)

表3 三組大鼠造模后病理組織學(xué)評(píng)分(±s)

組別 n Schmidt J 病理學(xué)評(píng)分A1:對(duì)照組20 2.74 ±1.12 A2:低劑量組 20 4.25 ±0.84 A3:高劑量組 20 6.33 ±2.92整體分析 F，P 23.225，0.000 A2 vs A1 LSD-t，P 2.488，0.016 A3 vs A1 LSD-t，P 6.739，0.000 A3 vs A2 LSD-t，P 4.251，0.000

3 討論

OPs多屬有機(jī)磷酸酯類化合物，具有大蒜樣臭味。一般不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑。有學(xué)者提出了有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的可能機(jī)制，如有機(jī)磷農(nóng)藥刺激接觸人體組織器官，被人體吸收后形成一種泛組織毒素，從而造成機(jī)體的多種組織器官損傷，如肝臟、腎臟、心臟、胰腺等，特別是神經(jīng)系統(tǒng)。OPs引起中毒的作用機(jī)制主要是抑制膽堿酯酶活性，使膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致膽堿能突觸內(nèi)乙酰膽堿蓄積，從而過度刺激毒蕈堿和煙堿樣受體。這一“膽堿能綜合征”表現(xiàn)為:出汗、流涎、支氣管分泌物增多、支氣管狹窄、瞳孔縮小、胃腸蠕動(dòng)增強(qiáng)、腹瀉、肌肉震顫和多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)。有機(jī)磷農(nóng)藥引起的死亡被認(rèn)為主要是由于抑制了位于腦干的呼吸中樞、引起支氣管狹窄和支氣管分泌物增多、呼吸肌的弛緩性麻痹［6］。

急性胰腺炎發(fā)病危急，疾病癥狀重，嚴(yán)重并發(fā)癥多，患者病死率高［7］。其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，以前的傳統(tǒng)觀點(diǎn)主要認(rèn)為是以胰酶的自身消化為主，而近年來人們逐漸提出許多新的學(xué)說。有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胰腺微循環(huán)障礙與急性胰腺炎發(fā)生有關(guān)，并影響到疾病發(fā)展。病理過程表現(xiàn)為:胰腺小葉內(nèi)動(dòng)脈痙攣、栓塞，造成支配區(qū)域缺血壞死，以缺血為特征的胰腺微循環(huán)障礙，另外多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子、緩激肽、血小板激活因子、內(nèi)皮素等作用于小葉動(dòng)脈，也能引起微循環(huán)障礙。以上過程可進(jìn)一步發(fā)展進(jìn)入胰腺炎的共同發(fā)生機(jī)制通路，最終激活多種蛋白酶，引起胰腺及其周圍組織自身消化，釋放多種炎癥因子，引起全身炎癥反應(yīng)。而通過我們長(zhǎng)期的臨床觀察及回顧國內(nèi)外眾多的臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒后能啟動(dòng)這一病理過程。OPs中毒患者血、尿淀粉酶大多出現(xiàn)不同程度的升高，部分患者甚至發(fā)生出血、壞死性胰腺炎，最終死于多器官功能衰竭。根據(jù)國內(nèi)外許多回顧性臨床研究報(bào)道結(jié)論，我們推測(cè)AOPP患者胰腺損傷致血、尿淀粉酶增高的機(jī)制可能為:(1)患者在中毒時(shí)，大量膽堿酯酶堆積，毒蕈堿樣癥狀引起胰腺等腺體分泌亢進(jìn)，迷走神經(jīng)處于興奮狀態(tài)，導(dǎo)致血液中淀粉酶的活性增高［8］;(2)OPs大多偏酸性，直接刺激胃黏膜產(chǎn)生大量胃泌素，使胰酶分泌增加，從而血清淀粉酶升高;(3)中毒后oddis括約肌處于痙攣狀態(tài)，造成胰管梗阻，導(dǎo)致胰腺腺泡及胰小管破裂，胰酶溢出，引起胰腺組織出血、壞死，發(fā)生胰腺炎［9］;(4)副交感神經(jīng)末梢的興奮導(dǎo)致毒蕈堿樣癥狀出現(xiàn)，致使平滑肌和腺體活動(dòng)增加，唾液腺分泌增強(qiáng)，也促使血清淀粉酶升高［10］;(5)可能由于應(yīng)激、高代謝狀態(tài)造成胰腺組織局部血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致胰腺缺血缺氧所致［11－12］。

血、尿淀粉酶是反映胰腺腺泡細(xì)胞損害的重要指標(biāo)。絕大多數(shù)胰腺炎患者在發(fā)病早期(2～12 h內(nèi))即可出現(xiàn)血淀粉酶升高，3～5 d后恢復(fù)正常;尿淀粉酶在血淀粉酶升高2 h后即可升高，且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。然而，對(duì)于動(dòng)物胰腺炎的診斷，國內(nèi)外現(xiàn)并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且多為個(gè)案報(bào)道為主，相關(guān)報(bào)道主要通過觀察大鼠血清淀粉酶變化，判定是否有胰腺炎，但并無淀粉酶升高的程度及胰腺炎診斷的關(guān)聯(lián)直接依據(jù)。張秀文等［13］等報(bào)道，Ams升高率與中毒患者病情輕重有密切關(guān)系，病情越重，Ams升高越明顯，我們揣測(cè)，動(dòng)物可能也有相似關(guān)系。黃冬等［14］的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也有相似報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)我們通過監(jiān)測(cè)大鼠淀粉酶的變化以及結(jié)合大鼠胰腺組織的病理學(xué)變化，明確大鼠是否出現(xiàn)胰腺損傷以及損傷的程度。

本文通過大鼠實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)點(diǎn)，從對(duì)照組、敵敵畏低劑量組到敵敵畏高劑量組，血清膽堿酯酶水平逐漸下降，提示隨著給藥濃度的增大，大鼠中毒程度逐漸加重。相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，3組大鼠血清淀粉酶水平逐漸升高，提示大鼠胰腺損傷逐漸加重。因此，我們推測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏中毒與大鼠急性胰腺損害存在因果關(guān)系，且隨著中毒程度加重胰腺損害更明顯。另一方面，通過大鼠胰腺組織病理學(xué)結(jié)果也印證了這一觀點(diǎn)。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，胰腺組織小葉間無水腫，無血細(xì)胞聚集，腺泡細(xì)胞無水腫及壞死，血管未見充血、出血，未見炎性細(xì)胞滲出，胰腺組織Schmidt J病理學(xué)評(píng)分(2.74±1.12)分。低劑量組大鼠胰腺實(shí)質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張、充血、出血明顯，并可見可見灶性炎性滲出，病理學(xué)評(píng)分(4.25±0.84)分，較對(duì)照組升高明顯。敵敵畏高劑量組光鏡下觀察胰腺組織病變程度更重，胰腺組織評(píng)分進(jìn)一步升高至(6.33±2.92)分。據(jù)我們所知，這是目前第一個(gè)探討有機(jī)磷農(nóng)藥中毒與胰腺損害實(shí)驗(yàn)的研究。而根據(jù)我科長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，急性胰腺損傷與有機(jī)磷中毒患者病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符［15－16］。因此，在臨床上對(duì)AOPP患者應(yīng)重視急性胰腺炎的診斷和救治。因此，在臨床上對(duì)AOPP患者應(yīng)重視急性胰腺炎的診斷和救治。

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