椎板切除神經(jīng)根損傷后聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品抗瘢痕粘連的效果①

蘇迪婭，劉松，王世煒，歷俊華，崇逢，李東風(fēng)，李睿智，萬虹

椎板切除神經(jīng)根損傷后聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品抗瘢痕粘連的效果①

蘇迪婭1，劉松1，王世煒1，歷俊華1，崇逢2，李東風(fēng)2，李睿智2，萬虹1

目的探索聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品防止神經(jīng)損傷后瘢痕粘連形成的效果。方法48只雄性Sprague-Dawley大鼠分為A、B兩組。大鼠切除L4-5椎板，暴露并損傷右側(cè)神經(jīng)根。A組術(shù)區(qū)涂抹生理鹽水，B組涂抹聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品。術(shù)后第1 (A1、B1)、2(A2、B2)、4周(A3、B3)對(duì)各組神經(jīng)根周圍粘連行Rydell評(píng)分；HE染色、Masson染色觀察，行粘連組織學(xué)Nussbaum評(píng)分；檢測(cè)血常規(guī)和肝、腎功能。結(jié)果各組Rydell評(píng)分：A1組Ⅰ級(jí)、A2組Ⅱ級(jí)、A3組Ⅲ級(jí)，B1組0級(jí)、B2組0級(jí)、B3組Ⅱ級(jí)。HE染色示B組較A組神經(jīng)根周圍粘連速度慢且瘢痕生長(zhǎng)疏松。Masson染色示B組較A組神經(jīng)根周圍瘢痕組織網(wǎng)稀疏散在，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其致密程度加深不明顯。組織學(xué)Nussbaum評(píng)分示，同時(shí)段A、B組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。各組大鼠血常規(guī)及肝、腎功能均在正常參考值范圍內(nèi)。結(jié)論聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品能有效防止椎板切除術(shù)后神經(jīng)根周圍及硬膜外瘢痕粘連形成，無毒副作用。

聚羧甲基葡萄糖胺；椎板切除術(shù)；神經(jīng)根；瘢痕；粘連；大鼠

[本文著錄格式]蘇迪婭，劉松，王世煒，等.椎板切除神經(jīng)根損傷后聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品抗瘢痕粘連的效果[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):45-48.

CITED AS:Su DY,Liu S,Wang SW,et al.Effect of a chitosan product on scarring and adhesion of injured nerve after laminectomy[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):45-48.

椎板切除術(shù)是脊柱外科常用的術(shù)式之一。椎板切除術(shù)后，在椎板缺損處可形成瘢痕組織，與硬膜及神經(jīng)根周圍粘連，最終壓迫、牽拉神經(jīng)根而引起腰腿疼痛，嚴(yán)重影響手術(shù)的長(zhǎng)期效果，同時(shí)為再次手術(shù)增加了困難和風(fēng)險(xiǎn)。我們依據(jù)聚羧甲基葡萄糖胺的理化性質(zhì)和瘢痕形成原理，觀察聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品對(duì)椎板切除術(shù)后抗瘢痕粘連的效果，探討聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品在神經(jīng)外科領(lǐng)域中抗瘢痕粘連的有效性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品由北京愛美客生物科技有限公司提供。K型電子天平：美國雙杰兄弟有限公司。AXTOV-mRC數(shù)字信號(hào)采集分析系統(tǒng)：尼康影像儀器銷售有限公司。RM2235手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、M400-E手術(shù)顯微鏡、EG1150H加熱石蠟包埋系統(tǒng)：德國LEICA公司。Masson染色試劑盒：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。

成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重200～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 模型制作及動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉。大鼠取俯臥位，固定頭部及四肢，腹部墊棉墊使脊柱輕度背弓。背部術(shù)區(qū)備皮，0.5%碘伏消毒。鋪無菌洞巾。觸摸肋弓定位，以L4棘突為中心，作脊柱正中切口，長(zhǎng)約5.0 cm，切開皮膚、背部筋膜，鈍性剝離骶棘肌，暴露L4-5椎板，自上而下切除L4-5椎板，暴露并損傷硬脊膜及同節(jié)段右側(cè)神經(jīng)根，壓迫止血。

動(dòng)物分為兩組：A組以棉片浸透生理鹽水，B組以聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品涂抹在神經(jīng)根和硬脊膜表面。A組3 min后取出棉片，以生理鹽水沖洗切口3次；B組待液態(tài)聚羧甲基葡萄糖胺凝聚為膠體狀態(tài)后，逐層縫合手術(shù)切口。術(shù)后動(dòng)物按組分籠飼養(yǎng)。所有大鼠術(shù)前、術(shù)后喂養(yǎng)及管理?xiàng)l件一致。根據(jù)觀察時(shí)間不同，A、B兩組又各分為3個(gè)亞組(n=8)：A1組與B1組為術(shù)后1周觀察組、A2組與B2組為術(shù)后2周觀察組、A3組與B3組為術(shù)后4周觀察組。

1.3 Rydell評(píng)分

術(shù)后每天觀察動(dòng)物的活動(dòng)情況。在術(shù)后1、2、4周取相應(yīng)亞組內(nèi)3只大鼠戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，完整切取手術(shù)節(jié)段脊柱，觀察硬膜外粘連情況。參考Rydell等制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[1]，將硬膜外及神經(jīng)根周圍粘連程度分為4級(jí)：0級(jí)，硬膜和神經(jīng)根與瘢痕組織或移植物無明顯粘連；Ⅰ級(jí)，硬膜和神經(jīng)根外有稀疏而散在的膜性粘連，瘢痕組織或填充物易與硬膜鈍性分離；Ⅱ級(jí)，硬膜和神經(jīng)根與瘢痕組織粘連較廣泛和致密，鈍性分離阻力較大，分離后硬膜仍保持完整；Ⅲ級(jí)，粘連廣泛、致密，硬膜和神經(jīng)根與瘢痕無法鈍性分離，銳性分離后的硬膜難以保持完整。進(jìn)行Rydell評(píng)分。

1.4 標(biāo)本制備

術(shù)后1、2、4周，取相應(yīng)亞組內(nèi)5只大鼠，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注，完整切取手術(shù)節(jié)段脊柱，4%多聚甲醛室溫固定24 h，30%甲酸室溫脫鈣5 d，清水沖洗1 d后浸蠟，包埋，石蠟切片，片厚4 μm。選取鄰片分別進(jìn)行HE染色與Masson染色。

1.5 HE染色

石蠟切片脫蠟入水，染色，脫水透明，封片。由3名對(duì)分組情況不知情的專業(yè)人員對(duì)各組粘連程度按照改良Nussbaum標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分：0分，無粘連；1分，少量粘連；2分，中量粘連；3分，大量粘連。

1.6 Masson染色

石蠟切片脫蠟入水，染色，先入蘇木精染液，鹽酸酒精分色后用Masson染色盒進(jìn)行4種染液(麗春紅-酸性復(fù)紅液、磷鉬酸溶液、亮綠溶液、冰醋酸水溶液)逐一滴染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.7 血常規(guī)及肝、腎功能檢測(cè)

每組分別取5只大鼠，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，真空采血管心臟取血3 ml，送檢驗(yàn)科檢測(cè)肝腎功能和血常規(guī)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Rydell評(píng)分

A1組有稀疏而散在的膜性粘連，Rydell評(píng)分Ⅰ級(jí)；B1組未見纖維粘連，未形成瘢痕組織，Rydell評(píng)分0級(jí)。A2組瘢痕粘連較A1組有所增加，硬膜與瘢痕組織粘連較廣泛和致密，鈍性分離阻力較大，分離后硬膜仍保持完整，Rydell評(píng)分Ⅱ級(jí)；B2組未見明顯纖維粘連，Rydell評(píng)分0級(jí)。A3組有明顯纖維瘢痕粘連，用利器難以分離，Rydell評(píng)分Ⅲ級(jí)；B3組硬膜外有稀疏而散在的膜性粘連，瘢痕組織或填充物易與硬膜鈍性分離，Rydell評(píng)分Ⅱ級(jí)(圖1)。

2.2 HE染色

光鏡下神經(jīng)組織與瘢痕纖維均呈粉紅色，細(xì)胞核藍(lán)染。A1組神經(jīng)根與脊髓表面粘連少量而松散；B1組神經(jīng)根表面基本無粘連。A2組神經(jīng)根與脊髓表面粘連較A1組稍致密，但致密度不高；B2組神經(jīng)根與脊髓表面粘連少量而松散。A3組神經(jīng)根周圍可見致密纖維組織包裹；B3組神經(jīng)根與脊髓表面粘連有稀疏的纖維組織(圖2)。A組和B組同時(shí)段大鼠神經(jīng)根與脊髓周圍的粘連程度Nussbaum評(píng)分均存在顯著性差異

(P＜0.05)。見表1。

2.3 Masson染色

脊髓組織與神經(jīng)根組織呈紅色，瘢痕組織呈藍(lán)綠色。與鄰片HE染色同時(shí)觀察，A1組神經(jīng)根與脊髓表面粘連少量，可見藍(lán)綠色粘連呈網(wǎng)狀，且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較松散；B1組神經(jīng)根表面基本無粘連。A2組神經(jīng)根與脊髓表面粘連較A1組稍致密，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中白色部分明顯減少；B2組神經(jīng)根與脊髓表面粘連少量而松散，綠色粘連呈絮狀結(jié)構(gòu)。A3組神經(jīng)根周圍可見致密纖維組織包裹；B3組神經(jīng)根與脊髓表面有稀疏的綠色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3)。

表1 術(shù)后各組瘢痕粘連程度Nussbaum評(píng)分比較

圖1 各組大體解剖學(xué)觀察(25×)

圖2 各組HE染色觀察

2.4 血常規(guī)及肝、腎功能檢測(cè)

各組大鼠的血常規(guī)及肝、腎功能檢測(cè)值均在正常范圍內(nèi)。見表2。

表2 各組血常規(guī)及肝腎功能比較

3 討論

椎板切除術(shù)是脊柱外科常見的術(shù)式之一，常用于腰椎間盤突出癥、脊柱腫瘤和椎管減壓等。術(shù)后在傷區(qū)會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)：細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒胞聚集，巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，成纖維細(xì)胞合成膠原與基質(zhì)量增加，早期為肉芽組織，晚期形成瘢痕。

對(duì)于椎板切除后瘢痕粘連成因說法多樣，得到最多認(rèn)可的是Songer等提出的“三維立體學(xué)說”[3]。他們研究發(fā)現(xiàn)，硬膜周圍的纖維化既來自后方損傷的骶棘肌，也來自前方損傷的纖維環(huán)和后縱韌帶。還有研究認(rèn)為，纖維化形成過程中，血腫和炎癥反應(yīng)也起到非常重要的作用。根據(jù)以上理論，我們認(rèn)為，三維立體包繞神經(jīng)根及硬膜，使它們與周圍組織達(dá)成某種程度物理隔離，同時(shí)又存在抗炎、止血效果的抗瘢痕粘連產(chǎn)品效果最佳。

聚羧甲基葡萄糖胺又名羧甲基殼聚糖，具有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)并減少膠原纖維合成的作用。此外，聚羧甲基葡萄糖胺還具有一定的生物活性，如止血[4]、抗感染[5]、提高免疫活性、減少瘢痕組織形成[6]等。聚羧甲基葡萄糖胺的降解產(chǎn)物主要為羧甲基葡萄糖胺，安全、無毒副作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)中由北京愛美客生物科技有限公司提供的聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品還具有獨(dú)特的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)。此產(chǎn)品由雙聯(lián)注射器和封裝在雙聯(lián)注射器中的溶液組成。雙聯(lián)注射器中溶液主要由聚羧甲基葡萄糖胺及雙重交聯(lián)劑配制而成。雙聯(lián)注射器中溶液經(jīng)雙聯(lián)注射器推出，混合均勻后，混合溶液初始呈流動(dòng)狀態(tài)，且具有一定黏附性；在化學(xué)、物理雙交聯(lián)作用下，可在40 s內(nèi)原位形成凝膠膜。該凝膠柔軟而有彈性，且具有一定的抗壓能力及拉伸強(qiáng)度，符合防粘連材料的臨床要求；凝膠pH值及滲透壓均接近體內(nèi)組織環(huán)境，符合防粘連材料的安全性要求；凝膠仍保留聚羧甲基葡萄糖胺抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)并減少膠原纖維合成的作用，符合防粘連材料的生物活性要求。不會(huì)發(fā)生失水，溶脹性較小，且溶脹后仍保持柔軟狀態(tài)，不影響效果；成膠阻隔效果不受組織液及血液存在的影響；凝膠膜柔軟有彈性，不會(huì)壓迫神經(jīng)；凝膠膜具有一定的抗壓能力及拉伸強(qiáng)度，不會(huì)因組織縫合過程中的牽拉而斷裂，不會(huì)因組織間的壓力而碎裂。

本研究顯示，此聚羧甲基葡萄糖胺產(chǎn)品可有效防止椎板切除術(shù)后瘢痕粘連形成，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無毒副作用。該產(chǎn)品操作簡(jiǎn)單、便捷，有望成為臨床有效、實(shí)用的抗神經(jīng)粘連產(chǎn)品。

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Effect of A Chitosan Product on Scarring and Adhesion of Injured Nerve after Laminectomy

SU Di-ya,LIU Song,WANG Shi-wei,LI Jun-hua,CHONG Feng,LI Dong-feng,LI Rui-zhi,WAN Hong.Beijing Neurosurgical Institute,Beijing Tiantan Hospital of Capital Medical University,Beijing 100050,China

Objective To investigate the effects of a chitosan product on scarring and adhesion after never injury in laminectomy in rats. Methods 48 male Sprague-Dawley rats were divided into group A and group B,and carried laminectomy of L4-5,and injured the right spinal nerve roots.The normal saline was smeared on the operation field in the group A,while the chitosan product was smeared in the group B. The adhesion was assessed with Rydell score 1(groups A1/B1),2(groups A2/B2)and 4(groups A3/B3)weeks after operation,while the spinal nerves were observed with HE staining and Masson staining,and the adhesion was assessed with Nussbaum score.The complete blood count and the series of blood chemistries and enzymes for liver and kidney functioning were measured.Results The Rydell scores of adhesion was I grade in group A1,II grade in A2 and III grade in A3,while was 0 grade in B1,0 grade in B2 and II grade in B3.The scar and adhesion contact more loosely in the group B than in the group A,and the Nussbaum score was less in the group B than in the group A at the same time(P＜0.05).The complete blood count and the series of blood chemistries and enzymes for liver and kidney functioning were in normal.Conclusion This chitosan product can prevent the formation of epidural scar and adhesion around the spinal and the nerve roots after laminectomy,with little toxicity and side effects.

chitosan;laminectomy;nerve roots;scar;adhesion;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.012

R651.2

A

1006-9771(2015)01-0045-04

2014-07-24

2014-08-22)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31440051)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所損傷修復(fù)室，北京市100050；2.北京愛美客生物科技有限公司，北京市100022。作者簡(jiǎn)介：蘇迪婭(1987-)，女，漢族，遼寧大連市人，碩士研究生，主要研究方向：周圍神經(jīng)損傷。通訊作者：萬虹(1963-)，女，漢族，吉林長(zhǎng)春市人，博士，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)。E-mail:wanhong96@163.com。