即時(shí)高壓氧對(duì)大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響①

李綱，張志強(qiáng)，張立新

即時(shí)高壓氧對(duì)大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響①

李綱，張志強(qiáng)，張立新

目的探討即時(shí)高壓氧對(duì)大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響。方法Sprague-Dawly大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(n=9)、高壓空氣組(n=9)、高壓氧組(n=9)、假手術(shù)組(n=5)，前三組應(yīng)用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血模型，高壓空氣組、高壓氧組在高壓氧艙內(nèi)造模，高壓氧組于造模后立即行高壓氧治療。各組大鼠均于術(shù)后6 h斷頭取腦，計(jì)算各組大鼠腦梗死占腦總體積百分比。結(jié)果與對(duì)照組相比，高壓氧組及高壓空氣組梗死百分比均顯著減少(P＜0.001)，高壓氧組減少得更顯著(P＜0.001)。結(jié)論即時(shí)高壓氧治療能夠降低大鼠腦局灶性缺血后梗死體積。

腦缺血；即時(shí)高壓氧；梗死體積；大鼠

[本文著錄格式]李綱，張志強(qiáng)，張立新.即時(shí)高壓氧對(duì)大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015, 21(1):39-41.

CITED AS:Li G,Zhang ZQ,ZHANG LX.Effect of immediate hyperbaric oxygen on infarct size in rats after focal cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):39-41.

腦是人體最重要的器官。腦組織質(zhì)量?jī)H占體質(zhì)量的2%～3%，但其需氧量卻占全身供給量的20%～25%，腦組織中幾乎無(wú)葡萄糖和氧的儲(chǔ)備，對(duì)缺血缺氧耐受性極差。腦血管病是目前世界上公認(rèn)的嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，發(fā)病率高，死亡率高，致殘率高。目前認(rèn)為，溶栓治療、神經(jīng)影像及氧療對(duì)患者功能恢復(fù)極為重要。若能在腦卒中發(fā)病數(shù)小時(shí)內(nèi)用先進(jìn)的神經(jīng)影像學(xué)確定診斷，并及時(shí)正確地采取高壓氧治療，可以為溶栓或應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)藥物爭(zhēng)取時(shí)間。早期溶栓治療非常有效[1]；“神經(jīng)保護(hù)”可以阻斷一種或多種缺血細(xì)胞死亡途徑，從而改善腦卒中的預(yù)后。但目前腦卒中藥物治療存在兩個(gè)致命的弱點(diǎn)：①由于溶栓治療時(shí)間窗較短(3 h)，臨床上只有5%左右的腦卒中患者受益；②雖然神經(jīng)保護(hù)藥物在動(dòng)物研究中顯示有一定療效，但目前沒(méi)有任何一種神經(jīng)保護(hù)藥在三期臨床研究中取得令人滿意的療效。所以，既能安全地挽救缺血神經(jīng)元，又能為腦卒中溶栓治療擴(kuò)大治療窗的治療方案將會(huì)有很大應(yīng)用前景[2]。

Acka[3]等、Li等[4]的研究顯示，高壓氧治療可有效減少大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型腦梗死體積。目前氧療的治療形式主要有兩種：常壓氧治療和高壓氧治療。醫(yī)用氧(氧濃度21%)的氧分壓在1個(gè)大氣壓(atmosphere,ATM,1 ATM=760 mmHg=101.325 kPa)的環(huán)境中為102 mmHg，常壓氧(氧濃度100%，1 ATM)的氧分壓也只能增至673 mmHg，而高壓氧(氧濃度100%，3 ATM)

可以使氧分壓增至2193 mmHg[5]。Singhal等報(bào)道，如果常壓氧治療能在MCAO模型成功后15或30 min內(nèi)進(jìn)行，可以顯著減少梗死體積[6]。多數(shù)研究表明，高壓氧及常壓氧治療急性缺血性腦卒中有良好的實(shí)驗(yàn)效果，即使高壓氧治療的基本機(jī)制仍不十分明確，但高壓氧的治療效果在許多文獻(xiàn)中優(yōu)于常壓氧。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

手術(shù)過(guò)程經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批并且符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程。雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g，大鼠飼養(yǎng)于12 h晝夜循環(huán)且室溫22～25℃的環(huán)境中，自由進(jìn)食及飲水。大鼠稱重，按體質(zhì)量從輕到重編號(hào)1～40，應(yīng)用SPSS 13.0中SYNTAX窗口輸入隨機(jī)分組程序，將40只大鼠分為以下4組：對(duì)照組(n=9)、高壓空氣組(n=9)、高壓氧組(n=9)、假手術(shù)組(n=5)，其余8只備用。所有大鼠均在MCAO模型制作成功后6 h，麻醉后處死。

1.2 模型制備

10%水合氯醛0.3～0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉并保持自主呼吸，如麻醉不足可適當(dāng)增加藥量。大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，取頸正中切口，鈍性分離下頜下腺，分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。在頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處靠近頸總動(dòng)脈根部結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端。用微血管夾快速夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在距頸總動(dòng)脈根部約0.5 cm處用4、5號(hào)針頭扎一直徑約0.35 mm小口，將直徑0.286 mm、頭部沾有硅膠的魚線插入小口，打開血管夾，使魚線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)有阻力感時(shí)停止進(jìn)入，進(jìn)線長(zhǎng)度距頸總動(dòng)脈根部約(18±0.5)mm。將魚線環(huán)狀結(jié)扎，固定于頸總動(dòng)脈根部。逐層縫合至皮膚。手術(shù)過(guò)程用電熱毯維持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 高壓氧組

應(yīng)用GY3200型高壓氧艙(煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)公司)，參數(shù)為升壓20 min，穩(wěn)壓(2 ATM)65 min，降壓20 min。穩(wěn)壓后吸100%純氧60 min，中間休息5 min。

大鼠于早8點(diǎn)進(jìn)入氧艙，于升壓過(guò)程(20 min)完成造模。將大鼠置于約1 m3的密閉容器中，連通氧氣管，容器內(nèi)溫度22～25℃，放入少量碳酸鈣以吸收大鼠呼出的二氧化碳。治療過(guò)程及治療后無(wú)大鼠出現(xiàn)癲癇癥狀。

1.3.2 高壓空氣組

在同一高壓氧艙內(nèi)造模，參數(shù)相同。將大鼠置于另一個(gè)1 m3的容器中，將容器頂蓋去除。不接氧氣管，大鼠呼吸氧艙中的空氣。

1.3.3 對(duì)照組

大鼠不進(jìn)入高壓氧艙中，于早8點(diǎn)造模，置于1 m3容器中。

1.3.4 假手術(shù)組

大鼠不進(jìn)入高壓氧艙中，于早8點(diǎn)手術(shù)，步驟同前，只是進(jìn)線長(zhǎng)度為距頸總動(dòng)脈根部10 mm。術(shù)后置于1 m3容器中。

1.4 梗死體積測(cè)定

大鼠蘇醒后采用Longa評(píng)分判斷模型是否成功：0分，無(wú)神經(jīng)損傷體征；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。0分及4分剔除。

術(shù)后6 h再次麻醉大鼠，斷頭取腦。腦組織迅速放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍15 min，冠狀切片，厚2 mm。第1刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與后葉尾極之間。切片置0.2 mmol/L PBS配成的1%2,3, 5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)中，錫箔紙蓋住后，放入恒溫水浴箱，37℃20 min，翻動(dòng)腦片，使其與染色液均勻接觸。切片取出，置0.1 mol/L PBS配成4%多聚甲醛中固定，24 h后用數(shù)碼相機(jī)拍照，OSIRIS圖像處理軟件計(jì)算梗死體積占全腦的百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，方差齊，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

動(dòng)物麻醉意外死亡1只，造模失敗3只，均用備用大鼠補(bǔ)足。備用大鼠仍用SPSS 13.0中SYNTAX窗口輸入隨機(jī)程序分組。納入統(tǒng)計(jì)32只。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死灶，不對(duì)該組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

高壓空氣組及高壓氧組梗死體積比均顯著小于對(duì)照組(P＜0.001)，高壓氧組顯著小于高壓空氣組(P＜0.001)。

表1 各組大鼠腦梗死體積比(%)

3 討論

腦卒中后，細(xì)胞損傷途徑主要有4種：興奮性中毒、氧/一氧化氮超載、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[7]。缺氧是造成上述問(wèn)題的重要原因，增加體內(nèi)氧氣水平理論上可以對(duì)缺血組織起保護(hù)作用。

早期認(rèn)為，高壓氧可以提高血漿內(nèi)游離氧濃度達(dá)數(shù)十倍，從而促進(jìn)氧分子擴(kuò)散至缺血組織，減少對(duì)血紅素結(jié)合氧的依賴。近年報(bào)道，高壓氧可以通過(guò)生化、分子及血流動(dòng)力學(xué)途徑產(chǎn)生作用。腦缺血缺氧時(shí)，ATP生成減少，谷氨酸鹽釋放，鈣離子超載，氧自由基過(guò)度產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)造成線粒體損傷。以上病理反應(yīng)造成了神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起腦水腫和血腦屏障功能減退，最終造成患者死亡或者遺留功能障礙。

Zhang等研究表明，高壓氧能保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫；使體內(nèi)谷氨酸鹽、葡萄糖及丙酮酸鹽相對(duì)穩(wěn)定；能抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡；反調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶；增強(qiáng)促進(jìn)細(xì)胞存活基因Bcl-2表達(dá)；增加紅細(xì)胞變形能力改善微循環(huán)減輕缺血-缺氧狀態(tài)[8]。Cheng等發(fā)現(xiàn)，高壓氧可以減少腦卒中大鼠模型環(huán)氧化酶-2 mRNA和蛋白質(zhì)水平，減少中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)，從而抑制炎性反應(yīng)[9]。還有研究顯示，在缺血再灌注模型中，高壓氧可減少多種凋亡基因表達(dá)，如誘導(dǎo)因子-1α、P54、caspase-9及caspase-3。這些抑制炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)。

本研究顯示，腦缺血后即刻予高壓氧治療，可以減少腦梗死體積。值得一提的是，即刻予高壓空氣治療亦能減少梗死體積，只不過(guò)效果較差。

由于梗死體積的測(cè)定依賴圖像處理軟件，因此在計(jì)算過(guò)程中難免造成誤差。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)同一圖像多次測(cè)量取平均值的方法得出最后梗死體積；拍攝時(shí)用同一相機(jī)、相同參數(shù)、固定拍攝距離及選擇自然光相似的條件時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍攝，盡量減少誤差。但并不能完全避免誤差的產(chǎn)生。

本研究選取的高壓氧介入時(shí)間極早，在臨床上很難實(shí)現(xiàn)，只能供臨床選擇高壓氧介入時(shí)機(jī)時(shí)借鑒。今后應(yīng)選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)介入高壓氧，并觀察多種指標(biāo)，為臨床工作提供更多依據(jù)。

國(guó)內(nèi)外高壓氧治療腦缺血的具體方案有很大不同，高壓氧介入時(shí)機(jī)、高壓氧治療療程、高壓氧治療劑量等，文獻(xiàn)報(bào)道尚無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)。本文選取即時(shí)高壓氧作為干預(yù)因素，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，可以完善高壓氧介入時(shí)機(jī)方面相關(guān)研究。

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Effect of Immediate Hyperbaric Oxygen on Infarct Size in Rats after Focal Cerebral Ischemia

LI Gang,ZHANG Zhi-qiang,ZHANG Li-xin.Department of Rehabilitation,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110000,China

Objective To investigate the effect of immediate hyperbaric oxygen on focal cerebral ischemia of rats.Methods Sprague-Dawly rats were randomly divided into control group(n=9),hyperbaric air group(n=9),hyperbaric oxygen group(n=9)and sham group(n=5).The middle cerebral arteries were occluded in the former 3 groups,while the hyperbaric air group and the hyperbaric oxygen group operated in the hyperbaric chamber,and the hyperbaric oxygen group accepted hyperbaric oxygen immediately after operation.All the rats were sacrificed 6 hours after operation and the percentage of volume of infarction in the brain slices was calculated.Results The percentage of infarction decreased in both hyperbaric oxygen group and hyperbaric air group compared with the control group(P＜0.001),and decreased more in the hyperbaric oxygen therapy than in the hyperbaric air group(P＜0.001).Conclusion Immediate hyperbaric oxygen therapy can reduce infarct size in rats after focal cerebral ischemia.

cerebral ischemia;immediate hyperbaric oxygen;infarct size;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.010

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0039-03

2014-08-25

2014-09-16)

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)中心，遼寧沈陽(yáng)市110000。作者簡(jiǎn)介：李綱(1985-)，男，遼寧沈陽(yáng)市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：高壓氧與腦血管病。通訊作者：張志強(qiáng)。E-mail:zhangzq@sj-hospital.org。