運動預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠血清炎癥因子水平的影響①

朱路文，葉濤，吳孝軍，姜云飛，唐強

運動預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠血清炎癥因子水平的影響①

朱路文1，葉濤2，吳孝軍2，姜云飛2，唐強1

目的探討運動預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子α (TNF-α)含量的影響。方法雄性Sprague-Dawley大鼠24只分為運動預(yù)處理組(n=8)、模型組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)。線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)缺血再灌注模型。再灌注后2 h、24 h分別行神經(jīng)功能缺損評分。隨后取材，HE染色觀察大鼠缺血側(cè)腦組織病理形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TNF-α、IL-1β及IL-6的含量。結(jié)果腦缺血再灌注后24 h，運動預(yù)處理組神經(jīng)功能評分較模型組改善(P＜0.05)，血清TNF-α、IL-1β及IL-6含量明顯降低(P＜0.01)；腦缺血區(qū)皮質(zhì)病理損傷減輕，間質(zhì)水腫程度減輕，細胞排列較整齊，缺血區(qū)變性和壞死的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。結(jié)論運動預(yù)處理可以降低急性腦缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)功能缺損。

腦缺血再灌注；運動預(yù)處理；腫瘤壞死因子α；白細胞介素-1β；白細胞介素-6；炎癥反應(yīng)

[本文著錄格式]朱路文，葉濤，吳孝軍，等.運動預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠血清炎癥因子水平的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(1):22-25.

CITED AS:Zhu LW,Ye T,Wu XJ,et al.Effects of exercise preconditioning on inflammatory response in serum in rat after cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):22-25.

腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/ R)是指缺血的腦組織在一定時間因側(cè)支代償復(fù)流或溶栓重新得到血液灌注后，其結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙不僅得不到恢復(fù)反而加重的現(xiàn)象。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的相關(guān)病理機制之一[1-2]。血清中白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥細胞因子的變化，與缺血后腦組織的炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)[3]。運動預(yù)處理已證實具有腦保護作用[4-5]。本實驗采用大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型，研究運動預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注后病理變化及促炎

性細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量(250±30)g，10～12周齡，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，動物合格證號：SCXK(黑) 2008001。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，濕度(65±5)%，噪音小于60 dB，12 h明暗交替(7:00～19:00照明)，自由食水。

1.2 主要試劑和設(shè)備

TNF-α、IL-1β、IL-6采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒：武漢博士德公司。MK3酶標(biāo)儀：MULTISKAN公司。KDC-160HR高速冷凍離心機：中科中佳科學(xué)儀器有限公司。RM2235型切片機、HI1210型攤片機、HI1220型烤片機：LEICA。JD-PT動物實驗跑臺：上海繼德教學(xué)實驗器材廠。

1.3 動物分組及干預(yù)

將24只大鼠進行編號、稱重后，采用隨機數(shù)字表法將其分為運動預(yù)處理組、模型組、假手術(shù)組，每組8只。運動預(yù)處理組采用電動跑臺連續(xù)訓(xùn)練3周后，制作MCAO模型，120 min后拔線恢復(fù)灌注。模型組自由活動3周后，制作MCAO模型，120 min后拔線恢復(fù)灌注。假手術(shù)組自由活動3周后，接受類似MCAO各項手術(shù)操作，但不插入線栓。

1.3.1 運動預(yù)處理

造模前連續(xù)訓(xùn)練3周，每周6天。實驗前電動跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，訓(xùn)練方案：速度8～10 m/min，坡度0°，每天20 min。剔除不愿跑臺的大鼠。正式訓(xùn)練方案[6-7]：速度15 m/min，坡度0°，每天30 min。

1.3.2 模型制備

參照Longa改良線栓法制備MCAO腦缺血再灌注模型[8]。術(shù)前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，術(shù)中動物保持自主呼吸，注意吸痰以保持呼吸道通暢，恒溫加熱板維持大鼠體溫(37.0±0.5)℃。頸部備皮，醫(yī)用碘伏常規(guī)消毒，頸正中偏右切口，鈍性分離皮下筋膜及右側(cè)腺泡；將腺泡向右側(cè)外翻，充分暴露手術(shù)區(qū)域，鈍性剝離右側(cè)胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌之間的肌間隙，剝離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。醫(yī)用縫合線結(jié)扎近心端頸總動脈及頸外動脈。在頸總動脈主干上扎活結(jié)，用動脈夾夾閉右側(cè)頸總動脈分叉處，在距活結(jié)約1.5 mm處剪一小口，輕插入線栓(直徑0.26 mm、長5 cm進口魚線，頭端過蠟處理)，尾端翹起，慢慢送入，同時判斷線栓是否進入翼腭突動脈(PPA)以避免造模失敗。從右側(cè)頸總動脈分叉處估算，線栓插入的深度約18～20 mm，使線栓經(jīng)右側(cè)頸總動脈分叉處進入頸內(nèi)動脈，越過大腦中動脈開口處，到達大腦前動脈起始部。扎緊備線，將腺泡復(fù)位，預(yù)留栓線于皮膚外，縫合并消毒。腦缺血120 min(完成線栓操作后計時)后，拔出栓線至右側(cè)頸總動脈主干分叉處。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評分

再灌注后2 h、24 h參照Longa等的5分制法進行神經(jīng)功能評分[8]。0分：無神經(jīng)功能缺失體征。1分：不能完全伸展患側(cè)前爪。2分：向患側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分：行走時向患側(cè)傾倒。4分：不能自發(fā)行走且意識障礙。首次評分1～3分的大鼠視為造模成功。0分、4分或死亡剔除，予以補充。評分由一名不知道實驗分組的實驗人員獨立完成。

1.5 取材與指標(biāo)檢測

再灌注24 h完成神經(jīng)功能評分后，水合氯醛0.40 ml/100 g腹腔注射麻醉，真空采血管心尖采血4 ml，室溫靜置30 min后，4℃3000 r/min離心15 min，分離、分裝血清，置于-20℃冰箱中待檢。對各組血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量進行檢測，檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

采血結(jié)束后，夾閉腹主動脈，行心內(nèi)灌注。先緩慢灌注生理鹽水(室溫)約100 ml，見大鼠前肢及兩肺變白后，改用4%多聚甲醛(4℃)灌注，待大鼠前肢劇烈抽動結(jié)束，再緩慢滴注15 min左右，至大鼠上半身呈現(xiàn)僵硬狀態(tài)。冰板上迅速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱過夜(＜24 h)。將腦組織取出，在視交叉后1 mm處冠狀位向后取2等份厚3 mm的腦組織，置于10%中性福爾馬林緩沖液中再固定18 h。常規(guī)石蠟包埋，制成厚3～5μm的組織切片，行HE染色，光鏡下(200×)觀察病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料均采用(±s)表示，組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。再灌注后2 h，與假手術(shù)組比較，模型組和運動預(yù)處理組已有明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)(P＜0.01)，評分為2分的居多，二者間無顯著性差異(P＞0.05)。再灌注后24 h，運動預(yù)處理組較模型組神經(jīng)功能缺損程度減輕(P＜0.05)。見表1。

表1 各組腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評分比較

2.2 HE染色

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)未見神經(jīng)元損傷及炎性細胞浸潤，神經(jīng)元細胞形態(tài)正常，細胞膜、核膜較清晰，核仁明顯，胞核呈類圓形，細胞數(shù)目眾多且排列整齊。模型組大鼠右側(cè)腦組織缺血皮質(zhì)出現(xiàn)水腫，細胞間隙變寬，結(jié)構(gòu)較疏松，空泡樣改變明顯，神經(jīng)細胞固縮呈三角形，胞漿嗜伊紅，細胞核固縮深染，核仁消失；染色質(zhì)呈新月形或核碎裂現(xiàn)象，有炎性細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞聚集現(xiàn)象，越遠離缺血皮質(zhì)區(qū)細胞形態(tài)越接近正常。運動預(yù)處理組大鼠腦缺血區(qū)皮質(zhì)病理損傷減輕，間質(zhì)水腫程度減輕，細胞排列較整齊，缺血區(qū)變性和壞死的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。見圖1。

2.3 血清TNF-α、IL-1β、IL-6

模型組、運動預(yù)處理組大鼠血清中TNF-α、IL-1β均較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，IL-6降低(P＜0.05)；與模型組比較，運動預(yù)處理組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6比較(pg/ml)

圖1 各組腦缺血再灌注后缺血側(cè)神經(jīng)病理(HE染色，200×)

3 討論

運動預(yù)處理，即缺血前給予多次重復(fù)的運動訓(xùn)練，可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，增強神經(jīng)保護并抵抗腦缺血引起的各種繼發(fā)性腦損傷[9-10]。與其他預(yù)處理方式比較，運動預(yù)處理簡便易行，易于被患者接受，具有很強的臨床可操作性。

目前認(rèn)為，運動預(yù)處理涉及多靶點、多水平、多通道的綜合作用。運動預(yù)處理后，缺血區(qū)皮層TNF-α受體表達降低，提示TNF-α參與重復(fù)運動預(yù)處理誘發(fā)的腦缺血耐受[11]。Guo等認(rèn)為，運動預(yù)處理還能通過改善血腦屏障功能，提高腦卒中后基底膜的完整性，降低腦損傷，其神經(jīng)保護作用與金屬基質(zhì)蛋白和金屬蛋白酶組織抑制因子表達失衡有關(guān)[12]。Tahamtan等認(rèn)為，運動預(yù)處理可以挽救更多缺血側(cè)大腦背側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元細胞，改善神經(jīng)行為功能[13]。此外，有學(xué)者認(rèn)為，運動預(yù)處理可能是通過下調(diào)代謝型谷氨酸受體1，抑制腦缺血后谷氨酸釋放，降低腦缺血/再灌注損傷[14]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，運動預(yù)處理可以減輕缺血后腦損傷，可能跟谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1兩條信號通路有關(guān)[15]。運動預(yù)處理的腦保護機制有待進一步闡明。

腦缺血再灌注后級聯(lián)炎癥反應(yīng)是重要的病理機制之一，也是近年來的研究熱點。Patel等發(fā)現(xiàn)，IL-37可以對抗急性再灌注損傷，縮小腦梗死體積，改善大腦損傷程度，發(fā)揮神經(jīng)保護作用；可能與IL-37可以降低急性、亞急性再灌注期間外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子的含量有關(guān)[1]。積雪草

皂苷可以降低海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞超活化和p38/分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)磷酸化水平，從而降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子的表達，發(fā)揮抗炎作用，改善短暫性腦缺血再灌注后記憶障礙[2]。腦缺血再灌注損傷后，受損腦組織細胞產(chǎn)生、分泌大量TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子，激活趨化因子，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，并且腦皮質(zhì)區(qū)比其他區(qū)炎癥反應(yīng)可能更持久、劇烈[16-17]。趨化因子可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞表面黏附分子表達，加強黏附分子與白細胞表面受體反應(yīng)，促進白細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附。同時趨化因子又是單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的活化信號，被激活的炎性細胞經(jīng)過上述過程，在短時間內(nèi)穿出血管壁，浸潤腦實質(zhì)，引起炎癥損傷。腦缺血再灌注損傷可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達，破壞血腦屏障，血腦屏障通透性增加[18-19]，使中樞腦組織的炎癥反應(yīng)信號經(jīng)由血液傳遞到外周，活化外周免疫系統(tǒng)中的炎性細胞。因此，外周血相關(guān)信號分子的變化可以反映腦組織局部的炎癥損傷程度及機體對局部損傷修復(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后24 h，運動預(yù)處理組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯降低，神經(jīng)功能改善；缺血區(qū)皮質(zhì)病理損傷明顯減輕。提示運動預(yù)處理可以通過降低腦缺血再灌注過程中炎癥反應(yīng)相關(guān)因子濃度，抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)的加劇，從而減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6降低，可能是腦缺血再灌注損傷應(yīng)激后，大量分泌的糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺類等應(yīng)激激素抑制免疫系統(tǒng)活化的結(jié)果[20]。

[1]Patel FJ,Volkmann DT,Taylor GW,et al.IL-37 reduces inflammatory response after cerebral ischemia and reperfusion injury through down-regulation of pro-inflammatory cytokines[J]. Cytokine,2014,69(2):234-239.

[2]李揚,羅勇,秦文熠,等.IKK-NBD多肽通過調(diào)節(jié)c-rel對抗局灶腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)炎癥反應(yīng)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2013,35(16):1721-1725.

[3]Chen S,Yin ZJ,Jiang C,et al.Asiaticoside attenuates memory impairment induced by transient cerebral ischemia-reperfusion in mice through anti-inflammatory mechanism[J].Pharmacol Biochem Behav,2014,122:7-15.

[4]Dornbos D,Zwagerman N,Guo M,et al.Preischemic exercise

reduces brain damage by ameliorating metabolic disorder in ischemia/reperfusion injury[J].J Neurosci Res,2013,91(6): 818-827.

[5]Zhang Q,Zhang L,Yang X,et al.The effects of exercise preconditioning on cerebral blood flow change and endothelin-1 expression after cerebral ischemia in rats[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2014,23(6):1696-1702.

[6]Ding Y,Li J,Luan X,et al.Exercise pre-conditioning reduces brain damage in ischemic rats that may be associated with regional angiogenesis and cellular overexpression of neurotrophin[J].Neuroscience,2004,124(3):583-591.

[7]Ding YH,Li J,Yao WX,et al.Exercise preconditioning upregulates cerebral integrins and enhances cerebrovascular integrity in ischemic rats[J].Acta Neuropathol,2006,112(1):74-84.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84-91.

[9]Zhang F,Wu Y,Jia J.Exercise preconditioning and brain ischemic tolerance[J].Neuroscience,2011,177:170-176.

[10]Stetler RA,Leak RK,Gan Y,et al.Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease:Paradigms and clinical significance[J].Prog Neurobiol,2014,114:58-83.

[11]Ding YH,Mrizek M,Lai Q,et al.Exercise preconditioning reduces brain damage and inhibits TNF-α receptor expression after hypoxia/reoxygenation:an in vivo and in vitro study[J]. Curr Neurovasc Res,2006,3(4):263-271.

[12]Guo M,Cox B,Mahale S,et al.Pre-ischemic exercise reduces matrixmetalloproteinase-9expressionandameliorates blood-brain barrier dysfunction in stroke[J].Neuroscience, 2008,151(2):340-351.

[13]Tahamtan M,Allahtavakoli M,Abbasnejad M,et al.Exercise preconditioning improves behavioral functions following transient cerebral ischemia induced by 4-vessel occlusion(4-VO) in rats[J].Arch Iran Med,2013,16(12):697-704.

[14]Yang X,He Z,Zhang Q,et al.Pre-ischemic treadmill training for prevention of ischemic brain injury via regulation of glutamate and its transporter GLT-1[J].Int J Mol Sci,2012,13(8): 9447-9459.

[15]Wang X,Zhang M,Yang SD,et al.Pre-ischemic treadmill training alleviates brain damage via GLT-1 mediated signal pathway after ischemic stroke in rats[J].Neuroscience,2014, 274:393-402.

[16]Wang Q,Tang XN,Yenari MA.The inflammatory response in stroke[J].J Neuroimmunol,2007,184(1/2)：53-68.

[17]曾靖,黎曉,黃志華.腦缺血再灌注損傷與炎癥反應(yīng)關(guān)系的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(3):698-700.

[18]Pera J,Zawadzka M,Kaminska B,et al.Influence of chemical and ischemic preconditioning on cytokine expression after focal brain ischemia[J].J Neurosci Res,2004,78(1):132-140.

[19]龐曉斌,謝欣梅,王保全,等.脈絡(luò)寧對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響研究[J].中成藥,2014,36(7):1347-1350.

[20]張亞敏,陳素輝,孫華,等.針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清IL-1β,IL-6表達的影響[J].針灸臨床雜志,2013,29(1): 60-63.

Effects of Exercise Preconditioning on Inflammatory Response in Serum in Rat after Cerebral Ischemia-reperfusion

ZHU Lu-wen, YE Tao,WU Xiao-jun,JIANG Yun-fei,TANG Qiang.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China

Objective To investigate the effect of exercise preconditioning on serum level of tumor necrosis factor α(TNF-α),interleukin(IL)-1β and IL-6 in rats after cerebral ischemia-reperfusion(I/R).Methods 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into exercise preconditioning group(n=8),model group(n=8)and sham group(n=8).The middle cerebral arteries were occluded for 120 min and re-perfused.All the rats were evaluated with neurological deficit score 2 hours,24 hours after I/R.The serum levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 was detected with enzyme-linked immunosorbent,and the pathology was observed with HE staining 24 hours after I/R.Results The neurological deficit score decreased in the exercise preconditioning group compared with that in the model group,as well as the serum TNF-α,IL-1β and IL-6(P＜0.05)24 hours after I/R.The pathological damage and interstitial edema alleviated in cerebral ischemia cortical, and the degeneration and necrosis of the neurons in the ischemic area significantly reduced in the exercise preconditioning group.Conclusion Exercise preconditioning may inhibit inflammatory response in I/R rats to protect neurological function from impairment.

cerebral ischemia-reperfusion;exercise preconditioning;tumor necrosis factor α;interleukin-1β;interleukin-6;inflammatory response

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.006

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0022-04

2014-11-19

2014-12-23)

1.哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項基金(青年后備人)(No.2014RFQGJ150)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計劃項目(No.2012RCL02)；3.黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團隊計劃項目(No.2013TD007)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡介：朱路文(1983-)，男，山東鄒城市人，博士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦卒中中醫(yī)康復(fù)的基礎(chǔ)研究。通訊作者：唐強(1963-)，男，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床。E-mail:tangqiang1963@163.com。