谷紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠運動功能障礙的影響①

張蕊，范思遠，梁珍，紀(jì)超，楊楠，劉雁勇，崔麗英，左萍萍

谷紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠運動功能障礙的影響①

張蕊1，范思遠2，梁珍1，紀(jì)超1，楊楠1，劉雁勇1，崔麗英2，左萍萍1

目的觀察谷紅注射液對腦缺血再灌注損傷模型大鼠運動功能障礙的影響。方法Sprague-Dawley大鼠90只分為假手術(shù)組、模型組、乙酰谷酰胺組、紅花注射液組和谷紅注射液組，采用大腦中動脈閉塞(MCAO)建立腦缺血2 h再灌注損傷模型。術(shù)后24 h給藥治療，連續(xù)給藥14 d。采用Bederson神經(jīng)缺損癥狀評分平衡桿測試觀察各組運動功能。酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色觀察各組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細胞存活率。結(jié)果模型組大鼠的過桿總時間比假手術(shù)組明顯增加(P＜0.01)，紅花注射液與谷紅注射液組過桿總時間較模型組降低(P＜0.05)。模型組大鼠缺血側(cè)黑質(zhì)TH神經(jīng)元細胞存活率較健側(cè)顯著減少(P＜0.001)，紅花注射液和谷紅注射液組TH神經(jīng)元的細胞存活率較模型組明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論谷紅注射液能顯著改善腦缺血再灌注大鼠的運動功能障礙，其保護作用可能與抑制黑質(zhì)神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷有關(guān)。

腦缺血再灌注；谷紅注射液；運動功能；黑質(zhì)；酪氨酸羥化酶

[本文著錄格式]張蕊，范思遠，梁珍，等.谷紅注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠運動功能障礙的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(1):12-16.

CITED AS:Zhang R,Fan SY,Liang Z,et al.Effects of Guhong Injection on motor dysfunction in cerebral ischemia-reperfusion rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):12-16.

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的腦血管疾病，致殘致死率極高[1]，其中約80%為缺血性腦卒中[2]。目前臨床上治療腦缺血主要采用梗死發(fā)生后的極早期進行溶解血栓、恢復(fù)血流，但是由于溶栓藥組織型纖溶酶原激活物(tPA)的治療時間窗很窄，限制了其應(yīng)用。

腦缺血損傷是一個可引起一系列復(fù)雜反應(yīng)的過程，迫切需要多種作用機制的治療藥物[3]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)引起黑質(zhì)遠隔區(qū)繼發(fā)性損傷可能是腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)不理想的重要原因[4]。而酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是黑質(zhì)合成多巴胺的標(biāo)志酶。

谷紅注射液為中西藥復(fù)方制劑，為乙酰谷酰胺和中藥紅花提取物制成的滅菌水溶液，其治療急性缺血性腦卒中的有效性得到大量臨床試驗證實[5-14]。本實驗采用線栓法建立大鼠MCAO模型，從整體水平上觀察

谷紅注射液對神經(jīng)功能障礙的影響，并探討其作用機制是否與保護遠隔區(qū)黑質(zhì)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

谷紅注射液(批號S201212111)、紅花注射液(批號S201212112)、乙酰谷酰胺注射液(批號S201212113)：通化谷紅制藥有限公司。生理鹽水：石家莊四藥有限公司。尼龍栓線：北京沙東生物技術(shù)有限公司，貨號2634-100。兔抗TH多克隆抗體：MILLIPORE公司，貨號AB152。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號PV-9001。

1.2 實驗動物

Sprague-Dawley大鼠90只，雄性，體質(zhì)量(180± 20)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，12 h周期明暗，自由進食與進水。室溫保持20～25℃。

1.3 模型制備

參照Longa法復(fù)制MCAO模型[15]，并加以改進。大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后進行手術(shù)。按實驗動物的3R原則給予人道關(guān)懷。術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于平板上，碘伏消毒。頸正中行長約2 cm切口。鈍性分離肌肉，充分暴露右側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)。分離血管與神經(jīng)。用手術(shù)線結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈主干近心端，徹底阻斷其血流。用微動脈夾暫時關(guān)閉頸總動脈分叉處近端，在頸總動脈近分叉處預(yù)先放置好一根手術(shù)線，然后用眼科剪在頸總動脈近分叉處剪一切口(切口與分叉處距離4～5 mm)，從切口處插入釣魚線。魚線在血管中前進約18～20 mm后固定。2 h后再麻醉大鼠，拔出魚線。

假手術(shù)組只分離血管不插魚線。

1.4 分組及給藥

采用隨機數(shù)表法將大鼠隨機分為以下5組：A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(乙酰谷酰胺注射液治療組)、D組(紅花注射液治療組)、E組(谷紅注射液治療組)。各組死亡大鼠不予補充。

術(shù)后24 h開始藥物干預(yù)。A組和B組腹腔注射生理鹽水1 ml/100 g，C組腹腔注射30 mg/ml乙酰谷酰胺1 ml/100 g，D組腹腔注射0.5 g/ml紅花注射液1 ml/100 g，E組腹腔注射谷紅注射液(紅花0.5 g/ml，乙酰谷酰胺30 mg/ml)1 ml/100 g。每天1次，連續(xù)14 d。定期測量大鼠體重并根據(jù)體重調(diào)整注射劑量。

1.5 神經(jīng)缺損癥狀評分

術(shù)后1 d、7 d和14 d(處死前)行Bederson神經(jīng)缺損癥狀評分。提鼠尾使大鼠離開地面約30 cm，觀察雙側(cè)前肢情況；將大鼠置于水平地面，從兩側(cè)推動其雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力有無差異；大鼠置于地面，觀察其自由行走情況。0分，無神經(jīng)缺損癥；1分，輕度神經(jīng)缺損癥狀(提尾時癱側(cè)前肢內(nèi)收，不能全伸直)；2分，中度神經(jīng)缺損癥狀(行走時向癱側(cè)傾倒)；3分，重度神經(jīng)缺損癥狀(向癱側(cè)旋轉(zhuǎn))。

1.6 平衡桿測試

給藥14 d后開始測試。平衡桿為長105 cm，寬4 cm，厚3 cm的木桿。木桿離地80 cm，兩端由木架支撐。木桿一端為起始區(qū)，長20 cm，另一端為終點區(qū)，終點區(qū)后接一個大鼠籠。平衡桿正下方放置約厚10 cm木屑墊料，以防大鼠跌傷。測試時，大鼠放在起始區(qū)，面對鼠籠，開始計時。記錄大鼠四肢均通過起始區(qū)(過桿潛伏期)和整個平衡桿(過桿總時間)的時間。潛伏期最大允許時間為1 min，過桿總時間為2 min[16]。測試前所有大鼠每天訓(xùn)練1次，共訓(xùn)練2 d，于第3天正式測試。

1.7 TH免疫組化染色

行為學(xué)評價后，每組取3只大鼠戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，剪開胸腔，充分暴露心臟，從左心尖處插入灌流針，剪開右心耳。先用PBS進行灌流，待血液沖洗干凈后改用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流約15 min。斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4℃過夜固定。固定1周后，轉(zhuǎn)入15%、20%和30%蔗糖溶液中梯度脫水，4℃放存。冰凍切片機切取冠狀腦片，片厚30 μm，收集于凍存液中，-20℃保存。挑取黑質(zhì)部位的腦片進行TH免疫組化染色。染色嚴(yán)格按照SP試劑盒說明進行。一抗為兔抗大鼠多克隆TH抗體(1∶800)，DAB染色、干燥封片，20×顯微鏡下觀察，每只大鼠取3張腦片，分別計數(shù)左(正常側(cè))、右(缺血側(cè))兩側(cè)大腦黑質(zhì)區(qū)各3個視野存活TH陽性細胞數(shù)，計算存活率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計檢驗。計量資料以(±s)表示。Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗，Levene法行方差齊性檢驗。滿足正態(tài)性或方差齊性，采用單因素方差分析；若不滿足正態(tài)性或方差齊性，則使用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗。單因素方差分析存

在顯著性差異時，使用最小顯著差法(Least Significance Difference,LSD)進行Post hoc檢驗。Kruskal-Wallis H檢驗存在顯著性差異時，使用Mann-Whitney U檢驗進行Post hoc檢驗。顯著性水平α=0.05。

根據(jù)實驗?zāi)康模瑢⒏鹘M拆分成兩種不同組合，分別進行統(tǒng)計檢驗。組合1：A組和B組，驗證是否造模成功。組合2：B組、C組、D組和E組，比較不同藥物干預(yù)的效果是否有差異。若組合2有顯著性差異，再進行Post hoc檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

Kruskal-Wallis H檢驗顯示，術(shù)后1 d、7 d、14 d，組合1神經(jīng)功能缺損評分有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，組合2無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較

2.2 平衡桿測試

Kruskal-Wallis H檢驗顯示，組合1過桿總時間有高度顯著性差異(P＜0.01)，組合2有高度顯著性差異(P＜0.01)，其中，B組、D組與E組間有高度顯著性差異(χ2=10.786,P=0.005)。Post hoc檢驗顯示，D組(U= 10.500,P=0.003)、E組(U=11.500,P=0.010)與B組間有顯著性差異。見表2。過桿潛伏期無顯著性差異。

2.3 黑質(zhì)區(qū)TH免疫組化染色

單因素方差分析顯示，組合1細胞存活率有非常高度顯著性差異(F=15.648,P＜0.001)。組合2有高度顯著性差異(P＜0.01)。與B組比較，D組和E組存活率均增加(P＜0.05)。見圖1、圖2。

表2 各組平衡桿測試過桿總時間比較(s)

圖1 各組黑質(zhì)部位TH陽性細胞存活率

3 討論

當(dāng)前，缺血性腦血管疾病發(fā)病率逐年增高，病死率達60%～80%；即使存活，也留有嚴(yán)重后遺癥。腦梗死患者會出現(xiàn)偏癱、共濟失調(diào)等肢體運動功能障礙，給患者的生活帶來嚴(yán)重困擾[17]。改善腦缺血損傷導(dǎo)致的運動功能障礙對于腦卒中患者的預(yù)后和功能恢復(fù)至關(guān)重要。

在臨床實踐中，紅花的安全性基本得到認可。乙酰谷酰胺是一種神經(jīng)肽，可以透過血腦屏障，加強細胞內(nèi)谷光甘肽合成，具有潛在的抗氧化損傷功能[18]。谷紅是紅花和乙酰谷酰胺的混合物，根據(jù)這兩種成分的特性，我們推測谷紅可能具有提高腦組織抵抗腦缺血的能力。本研究顯示，谷紅注射液治療可改善平衡桿測試的運動功能。

已有的報道顯示，采用大鼠MCAO模型不僅造成損傷側(cè)大腦皮質(zhì)、尾殼核和豆?fàn)詈巳毖Ｋ?，而且遠離梗死灶，但與之有大量纖維聯(lián)系的黑質(zhì)區(qū)域也相繼發(fā)生退行性改變，與最終運動功能障礙密切相關(guān)[19-20]。隨著神經(jīng)影像技術(shù)的廣泛運用，臨床上也觀察到患者中動脈梗阻或蒼白球受損都會導(dǎo)致同側(cè)黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元發(fā)生繼發(fā)性病變[21-23]。減少黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性損傷在腦缺血治療中具有重要意義。

我們在前期實驗中觀察到，經(jīng)谷紅注射液治療后，大鼠腦組織Caspase-3表達明顯下降，推測其抗急性腦缺血的作用可能與抗凋亡有關(guān)[18]。本研究觀察到，谷紅注射液對腦缺血后遠隔區(qū)黑質(zhì)繼發(fā)性損害有保護作用。黑質(zhì)-紋狀體通路是調(diào)控肢體運動的重要中樞，谷紅注射液改善大鼠運動功能障礙可能與保護黑質(zhì)神經(jīng)元有關(guān)。需要說明的是，由于我們給藥時間較長，過程中缺血側(cè)紋狀體出現(xiàn)了液化壞死，故未能對其進行切片染色。

隨著我國人口老齡化進程的加速，腦血管病已成為危害人類健康和生命的主要疾患。抗腦缺血藥物研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的研究熱點。臨床顯示谷紅注射液作為有效的抗腦缺血藥物，安全性較高，通過對其作用機制的深入探討，將會開辟出谷紅注射液更廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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Effects of Guhong Injection on Motor Dysfunction in Cerebral Ischemia-reperfusion Rats

ZHANG Rui,FAN Si-yuan,LIANG Zhen, JI Chao,YANG Nan,LIU Yan-yong,CUI Li-ying,ZUO Ping-ping.Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,China

Objective To evaluate the effects of Guhong Injection on motor dysfunction in rats after cerebral ischemia-reperfusion. Methods The middle cerebral arteries were occluded for 2 hours and re-perfused in Sprague-Dawley rats.They were divided in sham group, model group,Aceglutamide group,Safflowere group and Guhong group,which were intravenously administrated with normal saline,Aceglutamide,Safflower or Guhong 24 hours after operation,and continued for 14 days.They were tested with the beam-walking test after treatment.Tyrosine hydroxylase(TH)immunohistochemical staining was used to investigate the viability of neurons in the substantia nigra.Results The model group spent more time in the beam-walking test than that in the sham group(P＜0.01),and it decreased in the Safflower group and Guhong group compared with that in the model group(P＜0.05).The TH-positive neurons decreased in the model rat compared with that in the sham group(P＜0.001),and increased in both Safflower and Guhong groups compared with that in the model group(P＜0.01).Conclusion Guhong administration could significantly improve the motor dysfunction in rats after cerebral ischemia-reperfusion, which might be related to provent the neurons from injury in the substantia nigra.

cerebral ischemia-reperfusion;Guhong Injection;motor dysfunction;substantia nigra;tyrosine hydroxylase

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.004

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0012-05

2014-11-24

2015-01-05)

1.國家自然科學(xué)基金項目(No.81100801)；2.菏澤步長制藥有限公司項目。

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，北京市100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院，北京市100005。作者簡介：張蕊(1986-)，女，陜西渭南市人，博士研究生，主要研究方向：腦血管病與神經(jīng)藥理學(xué)。通訊作者：左萍萍。E-mail:pingping_zuo@126.com。