莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受體Tie-2的影響①

劉婷婷，孫芳玲，程華，艾厚喜，張麗，王文

莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受體Tie-2的影響①

劉婷婷，孫芳玲，程華，艾厚喜，張麗，王文

目的觀察莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1(Ang-1)及其受體Tie-2的影響。方法20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，每組4只。線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，術(shù)后予莫諾苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。術(shù)后7 d采用Western blotting法分析皮層Ang-1及其受體Tie-2的表達(dá)。結(jié)果模型組患側(cè)皮層Ang-1、Tie-2的表達(dá)均比假手術(shù)組明顯增加(P＜0.01)。莫諾苷大劑量組Ang-1、Tie-2的表達(dá)較模型組明顯提高(P＜0.01)，莫諾苷中、大劑量組Tie-2的表達(dá)較模型組顯著提高(P＜0.001)。結(jié)論莫諾苷能上調(diào)局灶性腦缺血大鼠缺血再灌注皮層Ang-1及受體Tie-2的表達(dá)，促進(jìn)血管再生。

莫諾苷；腦缺血再灌注；血管生成素1；Tie-2；血管再生；大鼠

[本文著錄格式]劉婷婷，孫芳玲，程華，等.莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受體Tie-2的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):9-11.

CITED AS:Liu TT,Sun FL,Cheng H,et al.Effects of morroniside on expression of Angiopoietin-1 and Tie-2 in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):9-11.

缺血性腦卒中是腦卒中最常見(jiàn)類型，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，缺血性腦卒中后，神經(jīng)血管單元的微環(huán)境改變，誘導(dǎo)血管發(fā)生。形態(tài)學(xué)分析表明，缺血后2～7 d梗死灶周邊可見(jiàn)毛細(xì)血管重建，缺血半暗帶擴(kuò)大，且有壁薄的血管形成，并在缺血后2～28 d逐漸發(fā)展成小血管，通過(guò)發(fā)芽和套疊的方式延伸到缺血中心區(qū)[2]。新生血管為新生神經(jīng)元提供重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[3]，神經(jīng)祖細(xì)胞也會(huì)沿著新生血管遷移到梗死周邊區(qū)[4-5]。Navarro-Sobrino等證明，腦缺血后血管新生是形成大腦新生微血管的重要過(guò)程，可以改善缺血周邊區(qū)域的組織低灌注[6]。缺血性腦損傷患者腦內(nèi)新生血管密度與患者的生存時(shí)間存在一定關(guān)系，新生血管密度增加多的患者，預(yù)后較好[7]。疾病刺激機(jī)體自身的血管新生反應(yīng)短暫而微弱，不足以很好改善腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)。通過(guò)外源性藥物或其他手段刺激血管新生，可能能更好地促進(jìn)缺血性腦損傷后的神經(jīng)康復(fù)。

血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang-1)是血管生成素家族的重要成員，Tie-2是其內(nèi)皮特異性酪氨酸激酶受體。研究表明，Ang-1/Tie-2系統(tǒng)在血管生成過(guò)程中

起關(guān)鍵作用[8-9]。Beck等證明，在腦缺血后恢復(fù)期，Ang-1/Tie-2水平的上調(diào)可以促進(jìn)腦缺血邊緣帶新生血管形成[10]。另外，缺血后Ang-1能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生過(guò)程的緊密聯(lián)系[11]。

莫諾苷是本課題組從中藥山茱萸中篩選出的有效成分，前期研究顯示，莫諾苷可以明顯改善腦缺血再灌注引起的神經(jīng)功能缺損，減少大腦梗死體積，使神經(jīng)元死亡減少，起到神經(jīng)保護(hù)作用[12-14]。我們發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能夠促進(jìn)大鼠腦缺血后梗死灶周邊皮層區(qū)域血管密度增加。因此，本研究在大鼠腦缺血再灌注模型上進(jìn)一步對(duì)莫諾苷對(duì)血管生成相關(guān)因子Ang-1及Tie-2表達(dá)的影響進(jìn)行研究，為莫諾苷對(duì)大鼠缺血性腦損傷后血管新生的作用及機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

莫諾苷由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室從山茱萸中提取制備，HPLC分析純度大于98.5%。Ang-1兔多抗(BA0636)：武漢博士德生物工程有限公司。Tie-2兔多抗(sc-324)：美國(guó)SANTA CRUZ公司。β-actin鼠單抗(TA-09)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(ZB-2301)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(ZB-2010)：北京市中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RIPA裂解液(P0013B)：碧云天生物技術(shù)研究所。BCA法蛋白定量試劑盒(P1511)：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。ECL Western Blotting Kit(32109)：美國(guó)THERMO-PIERCE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

20只SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性成年大鼠，體質(zhì)量260～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)：SCXK(京)2007-0001。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型后，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，每組4只。術(shù)后莫諾苷小、中、大劑量組予莫諾苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃給藥，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水。

1.3 模型制備

采用改良Longa線栓法[15]。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板上，頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈近心端，動(dòng)脈夾與頸總動(dòng)脈近心端之間結(jié)扎一道縫合線，不扎緊。在頸總動(dòng)脈接近頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處用眼科剪做一斜行細(xì)切口，將直徑為0.26 mm的尼龍線插入，稍扎緊縫合線，推動(dòng)尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約2 cm時(shí)，會(huì)有阻擋感，說(shuō)明栓線已越過(guò)大腦中動(dòng)脈，到達(dá)大腦前動(dòng)脈的起始部。記錄阻塞開(kāi)始時(shí)間，結(jié)扎頸總動(dòng)脈上端?？p合肌肉、皮膚。阻塞后30 min(若此時(shí)大鼠已蘇醒則需要再次麻醉)，拔出尼龍線。

假手術(shù)組除不插入尼龍線外，其他操作相同。

1.4 模型成功及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

參照Longa及Bederon評(píng)分方法[15-16]對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。將0分、1分及4分大鼠剔除，并補(bǔ)充各組設(shè)計(jì)所需大鼠數(shù)量。

1.5 Western blotting

術(shù)后7 d，大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉。迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)ィ〕龌紓?cè)皮層包入錫箔紙中，放入液氮中凍存片刻，-80℃保存。取患側(cè)皮層于5 ml EP管中稱重，加入預(yù)冷的裂解液7 μl/mg組織、PMSF 1 μl/100μl RIPA，冰上充分超聲粉碎。4℃靜止30 min，4℃12000 r/min離心30 min。取上清測(cè)定蛋白濃度，總蛋白與5×上樣緩沖液1∶4稀釋，95℃變性10 min。

Ang-1采用10%SDS-PAGE分離膠，Tie-2采用8%SDS-PAGE分離膠；濃縮膠用5%SDS-PAGE。電泳：濃縮膠電壓60 V，40 min，分離膠電壓90 V，90 min，分離蛋白。電泳后用0.45 μm NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；條帶在5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別用兔多克隆Ang-1抗體(1∶200)、兔多克隆Tie-2抗體(1∶200)和小鼠單克隆β-actin抗體(1∶1000)，4℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；ECL顯色1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。用Quanity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ang-1

模型組Ang-1水平比假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)；與模型組大鼠相比，莫諾苷大劑量組Ang-1水

平明顯增加(P＜0.01)。莫諾苷小、中劑量組表達(dá)水平與模型組相比有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

2.2 Tie-2

模型組Tie-2水平較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.001)；與模型組大鼠相比，莫諾苷中、大劑量組皮層Tie-2蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.001)。莫諾苷小劑量組表達(dá)水平與模型組相比有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

表1 各組患側(cè)皮層Ang-1、Tie-2灰度比較(/β-actin)

3 討論

在血管新生過(guò)程中，Ang-1/Tie-2對(duì)于新生血管的形成、重塑、穩(wěn)定、成熟都起舉足輕重的作用[17]。Ang-1/Tie-2特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和早期造血細(xì)胞[18]。受體Tie-2在大腦發(fā)育中的脈管系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)量較高，但成年后表達(dá)量維持在較低水平。Ang-1與其受體Tie-2結(jié)合后可以促進(jìn)新生內(nèi)皮細(xì)胞存活，調(diào)節(jié)血管萌芽和分枝形成，募集內(nèi)皮周圍支持細(xì)胞，最終促進(jìn)血管重塑和成熟[19-20]。

腦缺血后，大腦皮層內(nèi)Ang-1與Tie-2蛋白及mRNA表達(dá)水平均增加，這對(duì)于缺血后梗死周邊區(qū)域殘存血管結(jié)構(gòu)的維持、大規(guī)模血管重塑和血管新生起到關(guān)鍵作用[21-22]。Beck等發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷后，Ang-1/Tie-2水平的上調(diào)在時(shí)空和數(shù)量上調(diào)節(jié)梗死中心及半暗帶新生血管和側(cè)支循環(huán)的形成，促進(jìn)腦血流恢復(fù)，改善缺血周邊能量代謝，促進(jìn)功能恢復(fù)[10]。

本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注7 d后，大腦患側(cè)皮層Ang-1和Tie-2蛋白表達(dá)升高，與上述結(jié)果一致，提示缺血性腦損傷刺激促血管新生因子的生成，使神經(jīng)血管單元的微環(huán)境發(fā)生改變。給予莫諾苷治療后，Ang-1和Tie-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加。結(jié)合前期研究結(jié)果，我們推斷莫諾苷能夠通過(guò)調(diào)節(jié)局灶性腦缺血后Ang-1及其受體Tie-2的表達(dá)，在一定程度上改善腦內(nèi)神經(jīng)血管單元微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)促血管新生的作用，在缺血性腦損傷的治療中有著良好前景。

[1]Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nature Rev Neurosci,2003,4(5):399-415.

[2]Pettersson A,Nagy JA,Brown LF,et al.Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor[J].Lab Invest,2000, 80(1):99-115.

[3]Goldman SA,Chen Z.Perivascular instruction of cell genesis and fate in the adult brain[J].Nat Neurosci,2011,14(11):1382-1389.

[4]Tsai PT,Ohab JJ,Kertesz N,et al.A critical role of erythropoietin receptor in neurogenesis and post-stroke recovery[J].J Neurosci,2006,26 (4):1269-1274.

[5]Wang L,Chopp M,Gregg SR,et al.Neural progenitor cells treated with EPO induce angiogenesis through the production of VEGF[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28(7):1361-1368.

[6]Navarro-Sobrino M,Rosell A,Hernandez-Guillamon M,et al.A large screening of angiogenesis biomarkers and their association with neurological outcome after ischemic stroke[J].Atherosclerosis,2011,216 (1):205-211.

[7]Ohab JJ,Fleming S,Blesch A,et al.A Neurovascular niche for neurogenesis after stroke[J].J Neurosci,2006,26(50):13007-13016.

[8]Zhang ZG,Zhang L,Tsang W,et al.Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption of blood-brain barrier and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22 (4):379-392.

[9]Lin TN,Wang CK,Cheung WM,et al.Induction of angiopoietin and Tie receptor mRNA expression after cerebral ischemia-reperfusion[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(2):387-395.

[10]Beck H,Acker T,Wiessner C,et al.Expression of angiopoietin-1,angiopoietin-2，and tie receptors after middle cerebral artery occlusion in the rat[J].Am J Pathol,2000,157(5):1473-1483.

[11]Krupinski J,Kaluza J,Kumar P,et al.Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke[J].Stroke,1994,25(9):1794-1798.

[12]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res Bull,2010,83(5):196-201.

[13]Wang W,Sun F,An Y,et al.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J]. Eur J Pharmacol,2009,613(1-3):19-23.

[14]Wang W,Huang W,Li L,et al.Morroniside prevents peroxide-induced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28(2):293-305.

[15]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1): 84-91.

[16]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[17]Gale NW,Yancopoulos GD.Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases:VEGFs,angiopoietins,and ephrins in vascular development[J].Genes Dev,1999,13(9):1055-1066.

[18]Suri C,Jones PF,Patan S,et al.Requisite role of angiopoietin-1,a ligand for the TIE2 receptor,during embryonic angiogenesis[J].Cell, 1996,87(7):1171-1180.

[19]Beck H,Plate KH.Angiogenesis after cerebral ischemia[J].Acta Neuropathol,2009,117(5):481-496.

[20]Qin D,Trenkwalder T,Lee S,et al.Early vessel destabilization mediated by angiopoietin-2 and subsequent vessel maturation via angiopoietin-1 induce functional neovasculature after ischemia[J].PLoS One, 2013,8(4):e61831.

[21]Ma XL,Liu KD,Li FC,et al.Human mesenchymal stem cells increases expression of a-tubulin and angiopoietin 1 and 2 in focal cerebral ischemia and reperfusion[J].Curr Neurovasc Res,2013,10(2): 103-111.

[22]Zheng Q,Zhu D,Bai Y,et al.Exercise improves recovery after ischemic brain injury by inducing the expression of angiopoietin-1 and Tie-2 in rats[J].Tohoku J Exp Med,2011,224(3):221-228.

Effects of Morroniside on Expression of Angiopoietin-1 and Tie-2 in Rats after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion

LIU Ting-ting, SUN Fang-ling,CHENG Hua,AI Hou-xi,ZHANG Li,WANG Wen.Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing Geriatric Medical Research Center,Beijing 100053,China

Objective To explore the effects of morroniside on the expression of Angiopoietin-1(Ang-1)and Tie-2 in a rat after focal cerebral ischemia-reperfusion.Methods 20 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=4),ischemia group(n=4), and morroniside groups(low,medium and high dosage groups,n=4).The middle cerebral artery were occluded for 30 min,and re-perfused. Morroniside was administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg,90 mg/kg and 270 mg/kg after operation.The expression of Ang-1 and Tie-2 in the ischemic ipsilateral cortex were detected with Western blotting analysis 7 days after operation.Results The expression of Ang-1 and Tie-2 increased in the ischemia group compared with the sham group(P＜0.01),and both of them further increased in the morroniside groups of high dosage compared with the ischemia group(P＜0.01),and the expression of Tie-2 also increased in the morroniside groups of medium dosage(P＜0.001).Conclusion Morroniside could increase the expression of Ang-1 and Tie-2 in the ischemic ipsilateral cortex after ischemia-reperfusion in rats,suggesting promoting the angiogenesis after ischemia.

morroniside;ischemia-reperfusion;Angiopoietin-1;Tie-2;angiogenesis;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.003

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0009-03

2014-11-24

2014-12-11)

1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX09102201-016)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81173575；No.81373994)；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院院級(jí)課題。

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京重大疾病研究院，北京市100053。作者簡(jiǎn)介：劉婷婷(1988-)，女，漢族，河北滄州市人，博士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理。通訊作者：王文，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:lzwwang@ 163.com。