基于兼并引物的PCR擴增特定基因的效果比較

李志強,何　德,李翠新

(西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明 650224)

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基于兼并引物的PCR擴增特定基因的效果比較

李志強,何德,李翠新*

(西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明 650224)

摘要：根據(jù)NCBI上的DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ基因序列設(shè)計兼并引物，采用常規(guī)PCR、降落PCR、巢式PCR三種方法擴增糙皮側(cè)耳和阿魏側(cè)耳的拓撲異構(gòu)酶Ⅱ部分基因序列，比較三種方法擴增效果的特異性、靈敏度.結(jié)果表明，巢式PCR的靈敏度和特異性都優(yōu)于常規(guī)PCR和降落PCR，并且巢式PCR的靈敏度是常規(guī)PCR靈敏度的100倍以上，更加適合兼并引物擴增.這對利用兼并引物獲取特異基因具有指導意義.

關(guān)鍵詞：兼并引物；常規(guī)PCR；降落PCR；巢式PCR

表1　供試菌種名稱及來源

20世紀90年代后，隨著分生物學技術(shù)快速發(fā)展，PCR方法也得到廣泛的應(yīng)用.目前，常用的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、降落PCR、巢式PCR、免疫捕獲PCR、熒光定量PCR、Long-PCR等一系列PCR方法.降落PCR(Touchdown PCR)技術(shù)是Don等[1]1991年提出的，它是將退火溫度在多次循環(huán)中逐步降低的PCR技術(shù)，能夠很好的彌補兼并引物最佳退火溫度難以確定的缺點.巢式PCR在分子生物學中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[2-4]，它是在普通基PCR礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項PCR技術(shù)，它的基本原理是通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴增特異性DNA片段，第二對引物的功能是特異性擴增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片段.

DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ是真核生物代謝過程中重要的核酶，能夠讓一條完整的雙鏈DNA穿過它的活性區(qū)域缺口后，完成雙鏈DNA的解旋[5].本試驗基于RT-PCR基本原理，利用設(shè)計的兼并引物，采用常規(guī)PCR、降落PCR以及巢式PCR方法對側(cè)耳屬(Pleurotus)DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ序列進行了PCR擴增，并比較三者之間的特異性及靈敏度，以期為利用兼并引物進行基因擴增和獲取提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株為側(cè)耳屬的2個種，菌株來源及名稱見表1.

1.2試驗方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成搜索并獲取GenBank已經(jīng)發(fā)表的11種側(cè)耳屬菌株的DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ基因序列(金頂側(cè)耳，登錄號為EU430628.1；哥倫比亞側(cè)耳，登錄號為EU430631.1；黑杏鮑菇，EU430633.1；菌核側(cè)耳，EU430630.1；扇形側(cè)耳，EU430639.1；桃紅側(cè)耳，EU430634.1；白靈菇，EU430636.1；蓋囊側(cè)耳，EU430637.1；紅平菇，EU430638.1；鮑魚菇，EU430625.1；黃白側(cè)耳，EU430635.1)以及亞側(cè)耳菌株(元蘑EU430627.1)和離褶傘屬菌株(真姬離褶傘，EU430632.1)的拓撲異構(gòu)酶Ⅱ部分基因序列.通過Clustal對齊后，經(jīng)過Oligo6軟件分析后根據(jù)保守序列設(shè)計兩對簡并引物.TOP1：GGCBAARTTCAAGGCYGAC；TOP2：CTCCAGCCHGTKCCRATR；TOP3：GATCATGACNGATCARGATCA；TOP4：GCGACYTTRATTTCCTTCT(引物由華大生物科技有限公司合成).

1.2.2總RNA提取總RNA提取采用TRIzon Reagent總RNA提取試劑盒(北京康為生物科技公司)，提取后的RNA電泳檢測后放置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3三種PCR反應(yīng)特異性比較

1)cDNA第一鏈的獲取

將提取到的總RNA2μL，用逆轉(zhuǎn)錄酶RevertAidTM H Minus(Fermantas 公司)1μL，oligodT(10mM) 2μL，總反應(yīng)體系20μL反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA.

2)常規(guī)PCR

取2μL已經(jīng)獲得的第一鏈cDNA模板2μL，用TOP1和TOP2，TOP 3和TOP 4(濃度均為10mM)各2μL分別進行2次常規(guī)PCR擴增.加入Taq MasterMix (北京康為生物科技)12.5μL，反應(yīng)總體積都為25μL在PCR儀(BIO-RAD C1000 Thermal Cyclers)中進行常規(guī)PCR.TOP1和TOP2引物擴增循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s；72℃延伸30s，循環(huán)33次， 72℃終延伸5min.TOP3和TOP4擴增參數(shù)為：94℃預變性3min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，33次循環(huán)；最后72℃終延伸5min.

3)降落PCR

降落PCR利用cDNA第一鏈作為模版，TOP3作為上游引物，TOP4作為下游引物，反應(yīng)時退火溫度從58℃每循環(huán)降低1℃，直至52℃后，再按照上面的常規(guī)PCR反應(yīng)條件進行27輪循環(huán).

4)巢式PCR

巢式PCR的第一輪擴增取cDNA2μL，上下游引物TOP 1和TOP 2各1μL，加Taq Mix 12.5μL補至25μL總反應(yīng)體系.PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行33次循環(huán).

對巢式PCR第一輪產(chǎn)物稀釋50倍后取2μL做第二輪PCR模板，加入內(nèi)側(cè)引物TOP3和TOP4各2μL，進行25μL反應(yīng)體系擴增，用上述常規(guī)PCR反應(yīng)程序進行PCR擴增.

5)凝膠電泳檢測

對上述三種PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，將常規(guī)PCR中TOP3和TOP4擴增產(chǎn)物與降落PCR和巢式PCR進行產(chǎn)物特異性比較.

1.2.4三種PCR反應(yīng)的靈敏度比較對反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物做10、102、103、104、105倍的濃度梯度稀釋后取2μL作為常規(guī)PCR、降落PCR以及巢式PCR第一輪反應(yīng)的模版，常規(guī)PCR運用TOP3和TOP4作為引物，運用上面三種PCR方法對其進行擴增，對目的產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，比較其靈敏度.

1.2.5目的條帶片段克隆檢測對目的條帶片段進行膠回收，將回收片段連接到PJET1.2/blunt vector(Fermantas 公司)上，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上篩選克隆菌落，挑選單克隆菌落，接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h.將培養(yǎng)后菌液取20μL在沸水中煮沸10～15min，取1μL煮沸后的菌液做PCR反應(yīng)的模版，進行菌液PCR.

菌液PCR采用PJET1.2通用引物各0.3μL，Taq MasterMix(康為生物科技)5μL，PCR水3.4μL，總反應(yīng)體積10μL進行擴增.反應(yīng)程序為：95℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，進行25輪循環(huán).

1.2.6測序和生物信息學分析將菌液PCR的產(chǎn)物取4μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定質(zhì)粒載體中導入的片段大小是否與目的片段大小相同.將檢測出的含有目的條帶片段大小對應(yīng)的菌液1mL送樣進行序列測定(測序公司為華大科技有限公司).利用NCBI中的Blastp搜索軟件對測序獲得的序列進行分析鑒定.

注：M:marker； 1：糙皮側(cè)耳；2：阿魏菇圖1　總RNA提取電泳圖Fig.1　Total RNA extraction from strains

注：M：DL2000marker； 1：糙皮側(cè)耳； 2：阿魏菇圖2　巢式PCR第一輪擴增結(jié)果Fig.2　The first round of reaction products by nested PCR

注：1，2，3道： 糙皮側(cè)耳，5，6，7道：阿魏菇，4：陰性對照；1和5是常規(guī)PCR，2和6是降落PCR，3和7是巢式PCR圖3　三種PCR方法擴增特異性比較Fig.3　The comparison of specificity of three methods

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA提取結(jié)果檢測

提取的總RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1.總RNA條帶清晰，泳道無背景彌散，5S條帶較弱，28S條帶與18S條帶亮度接近2∶1.紫外分光光度計測定A260/A280的值介于1.8至2.0之間，說明RNA提取質(zhì)量較高,適于RT-PCR實驗.

2.2PCR特異性比較

由TOP1和TOP2引物進行的常規(guī)PCR擴增結(jié)果如圖2所示.供試菌株糙皮側(cè)耳和阿魏菇通過TOP1和TOP2引物進行PCR擴增得出的條帶呈現(xiàn)彌散狀，無相應(yīng)的1400bp大小的目的條帶，PCR結(jié)果特異性差.所以利用TOP1和TOP2引物對供試菌株進行PCR擴增無法獲得特異性目的條帶.

利用TOP3和TOP4引物進行常規(guī)PCR后與降落PCR和巢式PCR結(jié)果進行特異性比較，如圖3所示.片段大小與目的片段大小一致為600bp左右，糙皮側(cè)耳用三種PCR體系都可以成果擴增出特異性片段，阿魏菇只有降落PCR和巢式PCR有特異性條帶，并且巢式PCR擴增后的條帶要更加清晰.

圖3中可以看出對于兼并引物來說巢式PCR的特異性要高于常規(guī)PCR和普通降落PCR，并且巢式PCR對于不同菌種的擴增效果穩(wěn)定性更好.

2.3　常規(guī)PCR、降落PCR、巢式PCR的靈敏度檢測

三種PCR反應(yīng)靈敏度結(jié)果如圖4所示.檢測的條帶大小為600bp為目的條帶，常規(guī)PCR的靈敏度為10倍至102之間，降落PCR在模板稀釋103后條帶才變?nèi)?，而巢式PCR在模板稀釋105后仍然能夠檢測出明顯的條帶.表明巢式PCR靈敏度能夠達到普通PCR的100倍.

2.4　產(chǎn)物序列檢測

對巢式PCR擴增產(chǎn)物進行克隆檢測，挑取單克隆菌落進行菌落PCR，檢測如圖5.菌液PCR電泳檢測條帶為預期600bp大小.

將克隆后菌液進行測序獲取核苷酸序列，在NCBI上BLAST搜索，結(jié)果顯示Query coverage為40%～43%； Max ident值為94%～97%；E value值為0，搜索的結(jié)果擊中的是DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ序列，且得分高的均為側(cè)耳的DNA拓撲異構(gòu)酶II，沒有擊中其他類型的基因序列，表明三種PCR擴增條帶為所需的特異性目的條帶.

3　結(jié)論與討論

實驗對三種PCR方法擴增側(cè)耳屬拓撲異構(gòu)酶Ⅱ序列的特異性和靈敏度進行分析比較，得出常規(guī)PCR和降落PCR在通過兼并引物擴增目的序列時特異性和對屬內(nèi)不同菌種擴增的穩(wěn)定性不能得到很好的保證，而巢式PCR的特異性效果明顯.降落PCR在起始退火溫度較高的時候能夠特異性的擴增，即使退火溫度最終降到非特異性雜交的Tm值時，但此時目的產(chǎn)物已經(jīng)開始幾何擴增，在剩余的循環(huán)中遠遠超過非特異性擴增產(chǎn)物量[6].王天云在利用改良的降落PCR方法擴增鹽藻基因時，取得了不錯的效果[7].本實驗結(jié)果也證明了降落PCR在一定程度上可以提高PCR擴增的特異性與靈敏性，但是與巢式PCR的效果相比還存在一定差距.

在模板定量研究中發(fā)現(xiàn)巢式PCR在利用兼并引物擴增目的序列時靈敏度高于常規(guī)PCR和降落PCR并且是常規(guī)PCR靈敏度的100倍.雖然與李文杰[8]等檢測的巢式PCR是常規(guī)PCR靈敏度1000倍的結(jié)果有差

注：M：DL2000marker；1～5：稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105的常規(guī)PCR；6～10：稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105的降落PCR；11-15：稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105的巢式PCR圖4　三種PCR的靈敏度檢測Fig.4　The comparison of sensitivity of three methods

圖5　菌液PCR檢測Fig.5　The results of bacterial PCR

距，但是仍然可以證明巢式PCR具有高度靈敏性.其原因可能包括兩方面：首先樣本不同，本試驗的檢測對象為側(cè)耳，李文杰的研究對象為克氏原螯蝦.其次引物設(shè)計不同，本實驗采用兼并引物而非特異引物，而李文杰則是在特異引物的基礎(chǔ)上進行的研究.鹿連明等[9]對柑橘黃龍病菌的研究發(fā)現(xiàn)：針對同一基因，引物擴增特異性及靈敏度與擴增條帶大小無關(guān)，但是PCR擴增的目的基因不同，其靈敏度也會存在差異.因此實驗中的靈敏度檢測存在差異也可能與實驗?zāi)康幕蛴嘘P(guān).

試驗中巢式PCR會存在一些極弱的非特異性條帶，可能的原因是第一輪PCR擴增后會有殘留的第一對引物，產(chǎn)生極弱的競爭性，對巢式PCR結(jié)果形成干擾.所以第一輪PCR加入的引物量同樣很重要，并且第一輪PCR產(chǎn)物的濃度控制同樣也很關(guān)鍵.

利用密碼子的兼并性設(shè)計兼并引物擴增基因組DNA已經(jīng)得到充分的利用.但是兼并引物存在特異性過低，易導致錯配，引物利用率過低的局限性.建立一個適合兼并引物的PCR方法對目的基因進行擴增十分重要，實驗結(jié)果表明巢式PCR非常適合利用兼并引物進行基因特異性擴增.

參考文獻:

[1]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J]. Nucleic Acids Research,1991,19(14):4008-4010.

[2]Ledwidge S A,Mallard B A,Gibson J P,et al.Multi-primer target PCR for rapid identification of bovine DRB3 alleles[J] Animal Genetics，2001,32(4):219-221.

[3]Navaneetham D,Penn A S, Howard J F Jr,et al.TCR～V beta usage in the thymus and blood of myasthenia gravis patients[J]. Journal of Autoimmunity,1998,11(6):621-633.

[4]Atzori C,Agostoni F,Angeli E,et al.Combined use of blood and oropharyngeal samples for noninvasive diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia using the polymemse chain reaction[J].European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases,1998,17(4):241-246.

[5]黃晨陽,李翠新,張金霞.基于DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ基因部分序列的側(cè)耳屬系統(tǒng)發(fā)育分析[J].植物遺傳資源學報,2009,10(4):529-534.

[6]張貴星,袁保梅,許培榮.改良的降落PCR與普通PCR結(jié)果比較[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2003,38(3):352-354.

[7]王天云,張貴星,薛樂勛.一種簡便高效的改良降落PCR [J].中國生物工程雜志,2003,23(11):80-82.

[8]李文杰,周國勤,朱菲莉,等.檢測克氏原螯蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的巢式PCR方法的建立與初步應(yīng)用[J].南京師大學報,2009,32(2):98-102.

[9]鹿連明,胡秀榮,張利平,等.常規(guī)和巢式PCR對柑橘黃龍病菌的檢測靈敏度比較[J].熱帶作物學報,2010,31(8):1280-1287.

責任編輯：高山

Comparison of Gene Amplification Effect under Three Methods

of PCR Based on Degenerate Primers

LI Zhiqiang,HE De,LI Cuixin*

(College of Life Sciences,Sothwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Abstract：Three PCR methods(conventional PCR, touchdown PCR, nested PCR) were used to amplify the DNA topoisomeraseⅡ fragments of Pleurotus ostreatus and P.eryngii var ferulae with degenerate primers,which were designed with the gene sequences of DNA topoisomerase Ⅱ from NCBI. Their PCR sensitivity and specificity were compared. The result showed that the sensitivity and specificity of nested PCR were highest, and its sensitivity was 100 fold higher than conventional PCR, which indicated that the nested PCR was more suitable for PCR amplification under degenerate primers.This study will have some guidance significance to obtain the specific gene through degenerate primers.

Key words：degenerate primer; conventional PCR; touchdown PCR; nested PCR

DOI:10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.06.016

文章編號：1008-8423(2015)02-0174-05

通信作者：

作者簡介：朱照武(1989- )，女，碩士生，主要從事林特食品加工與開發(fā)；*莫開菊(1965- )，女，博士，教授，主要從事食品加工及天然產(chǎn)物化學的研究.

基金項目：湖北省研究與開發(fā)計劃項目(2010BBB016).

收稿日期：2015-05-19.

中圖分類號：S182

文獻標志碼：A