烏司他丁對(duì)百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用研究

吳 冰 鄭彥宏 侯振才 菅向東 崔 勇

百草枯(Paraquat，PQ)，又名對(duì)草快、克無蹤，屬于二吡啶類除草劑，是目前使用最廣泛的有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑之一，我國作為農(nóng)業(yè)大國，在農(nóng)村地區(qū)也有廣泛的使用。1966 年Bulhvant 首次報(bào)道了2 例百草枯中毒死亡病例［1］，此后世界各地相繼報(bào)道百草枯中毒病例。百草枯急性中毒后以肺為主要靶器官，導(dǎo)致嚴(yán)重低氧血癥的進(jìn)行性肺纖維化，患者常死于急性呼吸窘迫綜合征。目前針對(duì)百草枯中毒并無特效藥物，常規(guī)對(duì)癥治療效果極差，故百草枯中毒患者總病死率為20%～75%，口服病死率更高，達(dá)60%～80%，且存活者大多存在嚴(yán)重的肺間質(zhì)纖維化，預(yù)后極差［2］。烏司他丁(Ulinastin，UTI)作為一種廣譜的蛋白水解酶抑制劑最早應(yīng)用于急性胰腺炎的治療，近年來烏司他丁臨床廣泛應(yīng)用于危重癥的搶救與治療［3］，但其應(yīng)用在PQ 急性中毒的報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過建立急性口服PQ 中毒大鼠模型并通過UTI 進(jìn)行干預(yù)，試圖尋找一種臨床治療急性PQ 中毒新的方法。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 清潔級(jí)Wistar 大鼠45 只，購于山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，體重在240～260g，標(biāo)準(zhǔn)飼料。20%PQ 溶液購于英國先正達(dá)有限公司農(nóng)藥部，UTI 購于廣東天普醫(yī)藥有限公司，GSH-px 檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、SOD 檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)分組與模型建立 45 只健康Wister 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，利用隨機(jī)排列表將其分成三組:空白對(duì)照組(NS 組，N=5 只)灌胃給予等容量生理鹽水;PQ 組(N=20)和UTI 組(N=20)將PQ 按30mg/kg 用生理鹽水稀釋后一次灌胃注入染毒;UTI 組染毒后30 分鐘按100000u/kg 烏司他丁腹腔注射。每組取8 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)共4 個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5 只腹腔注射苯巴比妥鈉(100mg/kg)麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死。

1.3 血漿及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavage fluid，BALF)中SOD、MDA、GSH-Px 的測(cè)定 分別檢測(cè)8 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)共4 個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)測(cè)定血漿與BALF 中的SOD、GSH-px 活性與MDA 水平。SOD 用黃嘌呤氧化酶法;MDA 測(cè)定用硫代巴比妥酸比色法;GSH-Px 可以促進(jìn)過氧化氫(H2O2)與GSH 反應(yīng)生成H2O 及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH-Px 的活力可用其酶促反應(yīng)的速度來表示。

2.結(jié)果

2.1 血漿和BALF 中MDA 含量的變化 在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)PQ 組血漿與BALF 中MDA 含量較NS 組明顯升高，差異有顯著性(P ＜0.01);UTI 組血漿中MDA 水平較NS 組升高(P ＜0.01)，BALF 中MDA 含量與NS 組比較無顯著性差異。UTI組血漿與BALF 中MDA 含量升高程度較PQ 組低，差異有顯著性(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表1 血漿和BALF 中MDA 含量的變化(，nmol/ml)

表1 血漿和BALF 中MDA 含量的變化(，nmol/ml)

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.空 白 對(duì) 照 組;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.PQ 組。

2.2 血漿與BALF 中SOD 活性的變化 在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)PQ 組較NS 組血漿中SOD 活性逐漸降低，于24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)明顯降低(P ＜0.01);BALF 中SOD 活性于8 小時(shí)、24 小時(shí)明顯降低(P ＜0.01)，48 小時(shí)、72 小時(shí)明顯升高(P ＜0.01)。UTI 組血漿中SOD 活性與NS 組比較無顯著性差異，而BALF 中SOD 活性較NS 組于24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)時(shí)明顯升高(P ＜0.01)。UTI 組與PQ 組比較，血漿與BALF 中SOD 活性升高顯著(P ＜0.05 或P ＜0.01)。見表2。

表2 血漿與BALF 中SOD 活性的變化(，U/0.1ml)

表2 血漿與BALF 中SOD 活性的變化(，U/0.1ml)

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.NS 組;# P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.PQ 組。

2.3 血漿與BALF 中GSH-Px 活性的變化 在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)PQ 組和UTI 組在血漿與BALF 中GSH-Px 活性呈逐漸降低趨勢(shì)，48 小時(shí)、72 小時(shí)明顯低于NS 組(P ＜0.01)。但是UTI組與PQ 組比較，GSH-Px 活性下降程度明顯要小(P ＜0.01)。見表3。

表3 血漿與BALF 中GSH-Px 活性的變化(，U/ml)

表3 血漿與BALF 中GSH-Px 活性的變化(，U/ml)

注:* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs.NS 組;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.PQ 組。

3.討論

百草枯是廣泛應(yīng)用的除草劑，可導(dǎo)致人類和試驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)重的致命的肺纖維化，被稱作“百草枯肺”。肺是PQ 作用的主要靶器官是由于肺內(nèi)存在雙胺和聚胺類物質(zhì)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，PQ 與胺類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)通過肺泡Ⅱ型細(xì)胞的能量依賴性多胺攝取途徑，被肺泡Ⅱ型細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而攝取［4］，中毒后肺組織的PQ 濃度是血漿濃度的10～90 倍。PQ 被肺泡細(xì)胞攝取后經(jīng)過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基［5，6］，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，除直接損害非肺泡細(xì)胞膜主要成分-磷脂(富含多不飽和脂肪酸)外［7］，還可引起細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡［8］、膜透性增加從而引起細(xì)胞和線粒體腫脹導(dǎo)致肺損傷。MDA 是過剩的自由基攻擊細(xì)胞膜中多聚不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，間接反映氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度及抗脂質(zhì)過氧化損傷的能力;SOD 與GSH-Px 是構(gòu)成肺內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要酶，其活性間接反映機(jī)體清除自由基的能力，故MDA、SOD 和GSH-Px 常被用作自由基損傷的觀察指標(biāo)［9］。

通過本試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)PQ 染毒后血漿中GSH-Px、SOD 活力顯著下降，MDA 含量則顯著升高;BALF 中GSH-Px、SOD 活力均下降，MDA 含量升高。這些改變可能與PQ 在體內(nèi)代謝過程中生成活性氧自由基的過程有關(guān):PQ 進(jìn)入體內(nèi)先產(chǎn)生O2-，再在SOD 下形成H2O2［5］，故中毒早期血漿中SOD 活力降低明顯。PQ 中毒時(shí)晚期見BALF 中SOD 活力稍升高，而GSH-Px 活力顯著下降，這可能與PQ 中毒后期在肺臟產(chǎn)生的H2O2 較多有關(guān)。因?yàn)镠2O2半衰期長，容易透過細(xì)胞膜，可迅速形成較O2-更強(qiáng)的氧化劑OH-，在這個(gè)過程中要消耗大量的GSH-Px［10］。

UTI 是從健康男性新鮮尿液中分離純化的一種酸性糖蛋白，其分子由兩個(gè)Kunitz 型區(qū)域組成其基本骨架，屬自然界廣泛存在的Kunitz 型蛋白酶抑制劑，具有很廣的抑酶譜。降解后形成的低分子產(chǎn)物對(duì)酶抑制作用更強(qiáng)。烏司他丁分子中還具有與細(xì)胞膜受體識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，加上第10 尾絲氨酸上帶負(fù)電荷的硫酸軟骨素糖鏈，使其表現(xiàn)出穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜的生理作用。此外，UTI 對(duì)于兔油酸誘導(dǎo)的肺損傷保護(hù)［11］和對(duì)于先心病患者體外循環(huán)的干預(yù)作用等研究［12］均提示UTI 能有效減少氧自由基的產(chǎn)生和釋放，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)給予UTI 后與PQ 組相比較，血漿及BALF 中MDA 含量下降，SOD，GSH-Px 升高，且血中SOD 和BALF 中GSH-Px 升高顯著。

綜上所述，本試驗(yàn)證實(shí)氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化在PQ 中毒引起的急性肺損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用。UTI 可對(duì)抗急性PQ 中毒大鼠的氧化性損害，并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的能力，抑制脂質(zhì)過氧化作用，顯示出對(duì)于急性PQ 中毒大鼠肺損傷的保護(hù)作用，為臨床急性PQ 中毒患者的治療提供了新的思路和方法。

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