KLK3 基因變異與前列腺癌臨床表型的關(guān)聯(lián)研究

賈春媛 張毓洪 徐 勇 楊 闊 魏 東 張耀光 王建業(yè)※ 楊 澤

前列腺癌(PCa)是美國(guó)男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，僅2010 年就有200，000 新發(fā)病例和30，000 死亡病例［1］。在我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率中，PCa 已排在惡性腫瘤的第三位，它的發(fā)病率可用來(lái)評(píng)價(jià)50 歲以上我國(guó)男性期望壽命的風(fēng)險(xiǎn)性指標(biāo)［2］。截止目前為止，普遍認(rèn)為前列腺癌的發(fā)生是由環(huán)境和遺傳因素，兩者共同作用的結(jié)果［1，3，4］。Takata R 等人［5］進(jìn)行了一項(xiàng)有關(guān)日本男性前列腺癌患者GWAS 和復(fù)制的研究，他們的研究提示了相同的結(jié)果。此外，他們還報(bào)道了五個(gè)新的前列腺癌易感基因位點(diǎn)5P15［P(GC)=3.9×10-18］，GPRC6A/RFX6［P (GC)=1.6× 10-12］，13q22［P(GC)=2.8×10-9］，C2orf43［P(GC)=7.5×10-8］and FOXP4［P(GC)=7.6×10-8］。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們對(duì)前列腺癌的遺傳基礎(chǔ)有更深的理解，也表明前列腺癌的易感性在不同種族人群的遺傳異質(zhì)性。

為了確定這些變異是否與中國(guó)北方人群的前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，我們選取北京市和天津市PCa 患者與正常對(duì)照者，采用病例-對(duì)照方法對(duì)6 個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，了解它們?cè)赑Ca 患者的基因型與臨床特征之間的關(guān)系。

1.材料與方法

1.1 材料 自2000 年1 月～2010 年12 月，收集北京醫(yī)院泌尿外科和天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科研究所確診的266 例前列腺癌患者和288 例年齡匹配的健康對(duì)照者外周血標(biāo)本，同時(shí)還有他們的臨床資料，包括患者確診時(shí)的年齡，血清PSA，Gleason 分級(jí)和臨床分期。前列腺癌患者PSA超過(guò)20ng/ml，Gleason 評(píng)分≥8，和(或)病理分期≥Ⅲ期的被定義為侵入性前列腺癌。288 例對(duì)照者來(lái)自北京醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的體檢人群。PSA ＜4.0ng/ml，均無(wú)PCa 家族史。所有研究對(duì)象對(duì)此研究均知情同意。受試者均是來(lái)自我國(guó)北方地區(qū)的無(wú)親緣關(guān)系的漢族人群。

1.2 SNP 的基因型位點(diǎn)選擇與試驗(yàn)方法 根據(jù)歐美人群以前的GWAS 前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)研究，隨機(jī)選取6 個(gè)SNPs。這些位點(diǎn)包括rs13385191，rs12653946，rs1983891，rs339331，rs9600079 和rs2735839。全血基因組DNA 提取試劑盒由北京Bio Chain 公司提供。采用PTC-225 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR 高分辨率擴(kuò)增熔解曲線，包括初始變性95℃3 分鐘，隨后45 個(gè)循環(huán)95℃30 秒，退火30 秒，72℃延伸4 秒，經(jīng)過(guò)94℃30 秒而后降至24℃2 分鐘，進(jìn)行2 個(gè)循環(huán)后結(jié)束。PCR 產(chǎn)物通過(guò)Light Scanner TMHR-I 96 進(jìn)行HRM 分析。隨機(jī)選取6 個(gè)樣本基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，以確認(rèn)基因分型結(jié)果。PCR 的檢測(cè)方法為，預(yù)變性95℃3 分鐘，隨后在95℃30 秒進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，退火30 秒，72℃延伸30 秒，72℃2 分鐘完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0 版本處理數(shù)據(jù)。用比值比(OR)值和95%可信區(qū)間(95%CI)來(lái)評(píng)價(jià)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher 確切概率法。組間比較的差異設(shè)定P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Hardy-Weinberg 平衡對(duì)樣本群體基因型頻率的代表性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1 臨床數(shù)據(jù) 此次研究，前列腺癌患者的平均年齡72.17 ±7.72 歲，平均PSA 值46.42 ±143.11ng/ml。對(duì)照組平均年齡70.47 ±7.60 歲，平均PSA 值1.20 ±1.01ng/ml。兩組間比較無(wú)顯著性差異(P=0.129)。在表1 中，列出了266例前列腺癌患者的Gleason 評(píng)分、腫瘤分期、危險(xiǎn)度分級(jí)等臨床特征。

表1 前列腺癌患者的臨床基本特征

2.2 6 個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型與PCa 的關(guān)聯(lián)分析

2.2.1 前列腺癌與SNP 位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析:Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)對(duì)照組的基因型頻率，其分布具有群體代表性(P ＞0.05)。由遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析的6 個(gè)位點(diǎn)，經(jīng)前列腺癌與對(duì)照組比較表明，只有一種等位基因頻率，RFX6 基因(rs339331，C)與前列腺癌有顯著性關(guān)聯(lián)(OR=0.73，95%CI=0.57～0.94，P=0.013)。

2.2.2 前列腺癌相關(guān)的基因型:我們發(fā)現(xiàn)受試者與攜帶(CC+CT)基因型患者相比，這些攜帶TT 基因型中的RFX6基因(rs339331，C)更能降低前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.64，95%CI=0.45～0.90，P=0.008)(見(jiàn)表2)。

表2 6 個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型與前列腺癌等位基因的頻率分布［n(%)］

續(xù)表2

2.2.3 前列腺癌相關(guān)的危險(xiǎn)因素分析:我們通過(guò)前列腺癌病例對(duì)照研究，比較了6 個(gè)SNP 與相關(guān)的臨床表型，包括PSA 水平、年齡診斷、Gleason 評(píng)分、腫瘤分期和亢進(jìn)型前列腺癌患者的分層分析。結(jié)果表明:僅有13q22(rs9600079，T)基因型與腫瘤分期可能存在關(guān)聯(lián)(P=0.044，OR=2.34，95%CI=0.94～5.87)。對(duì)于其他SNPs，我們沒(méi)有觀察到前列腺癌病例與相關(guān)的臨床表型有任何顯著性差異(P ＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 rs9600079 位點(diǎn)基因型與前列腺癌患者臨床指征的關(guān)聯(lián)分析

3.討論

激肽釋放酶相關(guān)肽3(KLK3)基因的產(chǎn)物是用來(lái)檢測(cè)人的前列腺特異性抗原(PSA)，它是前列腺癌(PCa)臨床診斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物。G 蛋白偶聯(lián)受體RFX6，C2orf43 和FOXP4 信號(hào)在前列腺癌發(fā)展中起到重要作用。我們研究了其中的6 個(gè)位點(diǎn)，涉及位于KLK3 的rs2735839(G)，C2orf43的rs13385191(G)，F(xiàn)OXP4 的rs1983891(T)，RFX6 基因的rs339331(C)，5P15 的rs12653946(C)，13q22 的rs9600079(T)。通過(guò)研究這些中國(guó)北方前列腺癌患者基因變異的情況，來(lái)判斷他們與中國(guó)北方男性前列腺癌的發(fā)生是否有關(guān)。

KLK3 在19 號(hào)染色體屬于15 激肽釋放酶家族，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種目前存在于精漿中的蛋白酶，在臨床上稱(chēng)為PSA，這種蛋白的血清水平在診斷和監(jiān)測(cè)前列腺癌中發(fā)揮作用。Waters［6］公司生產(chǎn)的多種族序列發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)合并族群分析，KLK2/3(rs2735839)變異與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)可能關(guān)聯(lián)(OR=1.06;95%CI=0.97～1.16;P ＜0.05)。但我們的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)KLK3 基因群與前列腺癌存在顯著相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。

叉頭蛋白4(ForkheadP4，F(xiàn)OXP4)的功能是轉(zhuǎn)錄抑制因子來(lái)抑制肺的外周血特異性基因的表達(dá)，是轉(zhuǎn)錄內(nèi)分泌胰腺發(fā)育過(guò)程中直接分化胰島細(xì)胞所需的因子。它分化胰島細(xì)胞類(lèi)型并且生產(chǎn)胰島素，同時(shí)不需要胰腺PP(多肽生產(chǎn))細(xì)胞分化。調(diào)控因子RFX6 遷移到NEUROG3 的下游，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄參與β 細(xì)胞的成熟，從而限制了β 細(xì)胞中的分化。通過(guò)形成轉(zhuǎn)錄激活與RFX3 和有約束力的X-box 中的異源二聚體靶基因的啟動(dòng)子。

在亞洲人口中與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的四個(gè)SNPs，在歐洲人中也與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Batra 等［7］對(duì)1，357 例前列腺癌患者和歐洲的1，403 例健康的澳大利亞男性進(jìn)行了相同的研究。在日本人群中發(fā)現(xiàn)5P15 (rs12653946)與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(OR=1.20，95% CI:1.07～1.34;P=0.002)。高田等人［8］發(fā)現(xiàn)其5 個(gè)位點(diǎn)對(duì)前列腺癌具有易感性，在5P15［P(GC)=3.9×10-18］，GPRC6A/RFX6［P(GC)=1.6×10-12］，13q22［P(GC)=2.8×10-9］，C2orf43［P(GC)=7.5×10-8］和FOXP4［P(GC)=7.6×10-8］。后來(lái)Wang M等人［9］發(fā)現(xiàn)，3/4 的遺傳變異與前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)性(日本男性rs12653946 在5P15，P=4.33×10-8，rs339331 在6q22為4.43×10-5，rs9600079 在13q22 為8.42×10-4)。這些結(jié)果進(jìn)一步提供了證據(jù)，即在日本男性中確定的PCa 風(fēng)險(xiǎn)基因也有可能有助于中國(guó)男性前列腺癌易感性基因的研究。

總之，我們的研究結(jié)果表明，RFX6 基因(rs339331，C)變體與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，13q22(rs9600079，T)的變異關(guān)系到我國(guó)北方男性前列腺癌腫瘤分期。然而，在本項(xiàng)研究中的其他位點(diǎn)均沒(méi)有得到同樣的復(fù)制，可能表明其與中國(guó)北方的男性前列腺癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因無(wú)關(guān)。

1 Amundadottir L T，Sulem P，Gudmundsson J，et al.A common variant associated with prostate cancer in European and African populations［J］.Nat Genet，2006，38(6):652-658.

2 孫穎浩.我國(guó)前列腺癌的研究現(xiàn)狀［J］.中華泌尿外科雜志，2004，25(2):77-80.

3 Lichtenstein P，Holm N V，Verkasalo P K，et al.Environmental and heritable factors in the causation of cancer—analyses of cohorts of twins from Sweden，Denmark，and Finland［J］.N Engl J Med，2000，343(2):78-85.

4 Schaid D J.The complex genetic epidemiology of prostate cancer［J］.Hum Mol Genet，2004，13(1):R103-R121.

5 Takata R，Akamatsu S，Kubo M，et al.Genome-wide association study identifies five new susceptibility loci for prostate cancer in the Japanese population［J］.Nat Genet，2010，42(9):751-754.

6 Waters K M，Le Marchand L，Kolonel L N，et al.Generalizability of associations from prostate cancer genome-wide association studies in multiple populations［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(4):1285-1289.

7 Batra J，Lose F，Chambers S，et al.A replication study examining novel common single nucleotide polymorphisms identified through a prostate cancer genome-wide association study in a Japanese population［J］.Am J Epidemiol，2011，174(12):1391-1395.

8 Gudmundsson J，Sulem P，Gudbjartsson D F，et al.Genome-wide association and replication studies identify four variants associated with prostate cancer susceptibility［J］.Nat Genet，2009，41 (10):1122-1126.

9 Wang M，Liu F，Hsing A W，et al.Replication and cumulative effects of GWAS-identified genetic variations for prostate cancer in Asians:a case-control study in the ChinaPCa consortium［J］.Carcinogenesis，2012，33(2):356-360.