廣西壯族人群帕金森病LRRK2 基因的多態(tài)性分析

龐國防 梁慶華 呂澤平※ 胡才友 黃東挺 周博峰 黃春麗 余天智唐鳳川 秦嬌琴 楊 澤

帕金森病(Parkinson's Disease，PD)的病因及發(fā)病機(jī)制仍未明了，但普遍認(rèn)為是環(huán)境和遺傳因素交互作用的結(jié)果［1］，5%～10%的PD 患者表現(xiàn)為常染色體顯性或隱性遺傳，因此，對遺傳易感基因的篩查成為近期研究PD 的熱點之一。富亮氨酸重復(fù)激酶(Leucine-rich repeat kinase2，LRRK2)基因的一些單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)分別在常染色體隱性早發(fā)(50 歲前發(fā)病)及常染色體顯性晚發(fā)(50 歲后發(fā)病)PD 的發(fā)病中可能扮演重要的角色，而且呈現(xiàn)明顯的群體及地域特異性［2～4］。

LRRK2 基因位于染色體12q，全長145kb，包括51 個外顯子，編碼含2575 個氨基酸的dardarin 蛋白(震顫蛋白)，其功能涉及到底物的結(jié)合、底物的磷酸化、蛋白-蛋白之間的交互作用等。LRRK2 的錯義突變可導(dǎo)致不同程度的病理過程，例如R1441C，G2019S 和I2020T 突變明顯減少Akt1 的磷酸化，引起神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變，因此LRRK2 被認(rèn)為是家族性及散發(fā)性PD 的重要分子［6］。

本研究結(jié)合東亞人群常見的PD 相關(guān)基因變異，對壯族散發(fā)性PD 患者LRRK2 基因3 個SNP 進(jìn)行基因分型，包括LRRK2 的 rs34778348 (G2385R)，rs1491942 (N511K)，rs7133914(R1398H)，了解這些多態(tài)與廣西壯族PD 發(fā)病的相關(guān)性。

1.材料與方法

1.1 材料 ①PD 組:為2011 年5 月～2013 年12 月我院收治的散發(fā)PD 患者，無明顯家族史，共112 例，年齡64.29±12.93 歲，其中男性59 例，女性53 例，均為壯族，患者主要來自南寧及周邊的百色、河池等地區(qū)，并以50 歲為界分為早發(fā)及晚發(fā)亞組。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會運(yùn)動障礙及帕金森病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)［1，2］，由兩位資深神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生共同確定診斷。②對照組:為來自相同地區(qū)，年齡、民族、性別構(gòu)成匹配的健康中老年人，共156 例，年齡62.85 ±11.62 歲，其中男性84 例，女性72 例。研究對象除了詳細(xì)的神經(jīng)系統(tǒng)檢查外，常規(guī)的體格檢查及身高、體重、血壓等基本臨床數(shù)據(jù)亦一并采集。研究對象知情并同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集:所有研究對象禁食12 小時后于清晨空腹采肘靜脈血8ml，其中3ml ACD 抗凝血用于白細(xì)胞基因組DNA 提取，5ml 非抗凝血分離血清后用于血脂測定。

1.2.2 DNA 提取:采用經(jīng)典的酚-氯仿法。

1.2.3 SNP 基因分型:采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)進(jìn)行分型，引物參考文獻(xiàn)［7～10］進(jìn)行設(shè)計，由上海生工公司合成。各SNP 的基本特征、引物的序列、PCR 退火溫度、內(nèi)切酶種類、酶切產(chǎn)物大小等數(shù)據(jù)詳見表1。PCR 反應(yīng)總體積為20μL，其中2× Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(0.2μmol/μl)各1μL，Taq DNA 聚合酶［寶生物工程(大連)有限公司］1U，基因組DNA200ng(1μL)及ddH2O 7μL。SNP rs1801582 的PCR條件:94℃預(yù)變性5 分鐘后，94℃變性40 秒，59℃退火40 秒，72℃延伸50 秒，35 個循環(huán)，再72℃延伸10 分鐘。取10μl PCR 產(chǎn)物加入0.2U 限制性內(nèi)切酶Bsp1286I［寶生物工程(大連)有限公司］，72℃水浴消化4 小時，然后取酶切產(chǎn)物8μl 在2%瓊脂糖凝膠中80V 電泳30 分鐘。3 個SNP 的PCR-RFLP體系、條件及帶型特點見表1。

表1 各SNP 的基本特征及基因分型策略

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法:統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0 軟件。本研究中統(tǒng)計指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，以表示。基因頻率用直接計數(shù)法計算。Hardy-Weiberg 平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗。兩組計量資料的組間比較采用t 檢驗，兩組以上比較采用方差分析。分類資料組間比較采用卡方檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 研究對象的基本特征 兩組人群的基本臨床特征列于表2。如表所示，PD 組的飲酒比例、BMI、收縮壓均明顯大于對照組(均P ＜0.05)，而吸煙的比例小于對照組(P ＜0.05)，兩組性別構(gòu)成及年齡構(gòu)成無明顯差異(P ＞0.05)。

2.2 各位點的基因型頻率及等位基因頻率分布 PD 組和對照組在3 個多態(tài)位點上的基因型及等位基因頻率分布情況及其與PD 的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果詳見表3。3 個SNP 的分布均符合H-W 平衡。在LRRK2 基因的rs34778348 位點，A 等位基因攜帶者罹患PD 的風(fēng)險也明顯升高(OR=1.632，95%CI:1.238～2.346)但P 值稍弱(0.029)，總體上PD 組等位基因A 及純合突變型AA 的頻率明顯高于對照組(P ＜0.05)。另2 個SNP 的基因型和等位基因頻率分布在兩組間無差異(P=0.445～0.894)。

表2 研究對象的基本臨床特征

表3 廣西壯族人群散發(fā)性帕金森病的相關(guān)基因及致病基因研究［n(%)］

3.討論

本研究的主要結(jié)果是，在壯族PD 患者中，LRRK2 rs34778348(G2385R)的頻率明顯高于對照組(23.2% vs 7.4%，P ＜0.01;8.5% vs 4.2%，P ＜0.05)，攜帶rs34778348 A 等位基因的個體患PD 的風(fēng)險是普通人群的1.632 倍，但基因型及等位基因頻率在早發(fā)和晚發(fā)PD 之間無差異。因此，該位點可能是壯族散發(fā)性PD 的易感因素之一。而在LRRK2 rs1491942 位點，PD 組的C 等位基因頻率明顯高于對照組(43.4% vs 32.8%，P=0.006)。可見，PD 與LRRK2 基因的關(guān)聯(lián)存在明顯的群體特異性。

本組病例LRRK2 rs34778348(G2385R)等位基因A 的頻率為8.5%，對照組為4.2%，A 攜帶者罹患PD 的風(fēng)險明顯高于普通人群，與中國西南漢族及東亞主要群體的結(jié)果類似［7，16］。此位點位于LRRK2 基因第48 外顯子的WD40 結(jié)構(gòu)域，使第7153 號核苷酸G 變成A，相應(yīng)密碼子GGG 變成GGA，編碼同樣的氨基酸Gly，被認(rèn)為是一種沉默的、中性的點突變，在多個西方群體中沒發(fā)現(xiàn)PD 患者與普通對照間的頻率差異［2］。本組人群及其他東亞群體PD 患者高頻等位基因A 的潛在生物學(xué)意義尚不清楚，與其他未知的致病突變存在連鎖不平衡可能是其解釋之一。

本研究所測基因位點有限，需要對基因其他位點和其他基因的變異篩查以及不同基因型PD 患者表型的長期隨訪進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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