基于HRM 的小擴(kuò)增子法研究ABCA1 基因變異與良性前列腺增生及前列腺癌的關(guān)聯(lián)

張 政 孫 亮 李星慧 魏 東 王曉明 楊 澤 王建業(yè) 張毓洪

ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1，ATP-binding cassette transporter A1)與疾病的潛在關(guān)聯(lián)近年來被廣為關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)其與上皮卵巢癌［1］、心血管疾病及膽固醇代謝病相關(guān)［2］。ABCA1 可參與磷脂類和膽固醇的跨膜逆轉(zhuǎn)運(yùn)［3］，與PCA 的進(jìn)展密切相關(guān)，是前列腺上皮細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的最主要通路分子［4］。由于膽固醇與雄激素合成關(guān)系密切，而雄激素的紊亂與男性良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCA)關(guān)系密切。BPH 及PCA 已經(jīng)成為近年來影響我國老年男性的重要疾病［5］，但是關(guān)于ABCA1 基因變異與BPH 和PCA 的相關(guān)性還缺乏研究。

HRM 技術(shù)具有高通量、高敏感度且經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，目前已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的遺傳分析，本研究通過建立基于HRM 的小擴(kuò)增子(small-amplicon)技術(shù)，并初步進(jìn)行臨床分型應(yīng)用，探索ABCA1 基因變異rs2230806，rs2066882 與BPH 及PCA 的關(guān)聯(lián)。

1.材料與方法

1.1 研究對(duì)象 在北京醫(yī)院2011～2014 年建立的遺傳資源庫中，按照十二五科技支撐計(jì)劃中的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終共納入BPH 患者391 例，PCA 患者222 例，真陰性對(duì)照組86 例(正常PSA/IPSS 評(píng)分)。所有研究對(duì)象均為漢族北方人群，均簽署知情同意書，研究流程經(jīng)北京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采集外周靜脈血，EDTA3K 抗凝，-20℃保存。

1.2 試劑與儀器 全基因組DNA 提取試劑盒，PCRmix 購自北京康為世紀(jì)公司，飽和熒光染料購自美國Idaho 公司。主要儀器包括:美國Idaho 公司Lightscanner TMHR-I 96 高分辨熔解曲線(high resolution melting，HRM)檢測(cè)系統(tǒng);Nanodrop ND-2000 進(jìn)行DNA 定量;美國BIO-RAD 公司PTC-225 型PCR 擴(kuò)增儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA 的提取:每個(gè)樣本取300μl 全血，按試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA 提取，工作液濃度稀釋至20ng/μl，儲(chǔ)于4℃。

1.3.2 小擴(kuò)增子(small-amplicon)擴(kuò)增:從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查取ABCA1 基因rs2066882 和rs2230806 附近的基因序列，用Oligo7.0 軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物(表1)。試驗(yàn)采用10μl 的PCR 反應(yīng)體系，包括PCRmix5ul，水2.8μl，DNA 模板1μl，飽和熒光染料0.8μl，高低溫內(nèi)參、上下游引物各0.1μl。PCR 程序:95℃預(yù)變性5 分鐘后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性30 秒，退火30秒，72℃延伸10 秒，共35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 分鐘。

1.3.3 HRM 檢測(cè):PCR 反應(yīng)體系中加入飽和熒光染料(LC-Green-plus)會(huì)在DNA 擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)中嵌入到堿基之間，隨著逐漸升DNA 解鏈，釋放堿基之間的熒光信號(hào)，根據(jù)雙鍵與三鍵之間熒光信號(hào)強(qiáng)度不同進(jìn)行基因分析。Lightscanner TMHR-I 96 所采集的熔解曲線的溫度范圍為45℃～95℃，用LightScanner Call IT 軟件的small-amplicon 系統(tǒng)分析采集到的曲線，判定具有相同基因型的個(gè)體。從每個(gè)SNP 位點(diǎn)的3 個(gè)不同基因型中，隨機(jī)抽取30%的樣本，進(jìn)行Sanger法測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 樣本的群體代表性均經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)進(jìn)行檢驗(yàn)。使用SPSS 16.0 軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)基因型或等位基因頻率的比較用Fisher 確切概率法或Pearson 卡方檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為0.05)。

2.結(jié)果

2.1 rs2066882 和rs2230806 的基因分型結(jié)果 利用HRM 小擴(kuò)增子法成功對(duì)rs2066882 和rs2230806 進(jìn)行分型，熔解曲線見圖1，其中最先解鏈的為雜合子，其次為AA/TT 純合子，最后解鏈的為GG/CC 純合子。各基因型抽取30%經(jīng)Sanger 測(cè)序驗(yàn)證完全一致。

2.2 BPH 風(fēng)險(xiǎn)基因關(guān)聯(lián)分析 rs2230806 的AA/AG/GG基因型分布在PCA、BPH 和正常對(duì)照組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.323，P=0.858，df=4);rs2066882 的AA/AG/GG 基因型分布在PCA、BPH 和正常對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.234，P ＜0.001，df=4)。ABCA1 基 因 rs2066882 和rs2230806 在PCA 組、BPH 組和正常對(duì)照組間的分布情況見表2，結(jié)果顯示，rs2066882 的不同基因型在PCA 組和對(duì)照組(P ＜0.001，OR=3.708，95%CI=2.088～6.586)，BPH 組和對(duì)照組(P ＜0.001，OR=3.871，95%CI=2.308～6.492)間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 ABCA1 基因2 個(gè)變異的基因型在PCA、BPH 及正常對(duì)照組中的分布

3.小結(jié)

大數(shù)據(jù)時(shí)代對(duì)遺傳診斷技術(shù)提出了新的要求，傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶消化及測(cè)序技術(shù)存在通量低、成本高、操作復(fù)雜等限制［6］，難以進(jìn)行推廣實(shí)施。本文建立的基于高分辨熔解曲線(HRM)技術(shù)的變異位點(diǎn)小擴(kuò)增子分型技術(shù)是一種檢測(cè)通量高、敏感度高、操作簡(jiǎn)單，且經(jīng)濟(jì)的SNP 分型技術(shù)［7］，極具臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于前列腺癌和良性前列腺增生的易感人群，需早期進(jìn)行基因分型，并掌控其最佳干預(yù)時(shí)機(jī)，通過早期控制生活方式和環(huán)境因素等達(dá)到降低疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的目的。本研究通過HRM-Idaho LightScanner 分析，對(duì)391 例BPH患者，222 例PCA 患者和86 例正常對(duì)照者的DNA 樣本進(jìn)行分型應(yīng)用。

本文所建立的基于小擴(kuò)增子法的HRM 分型技術(shù)成功對(duì)ABCA1 基因變異rs2230806，rs2066882 兩個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，不受限于基因變異的位置特征，可成功區(qū)分兩個(gè)變異位點(diǎn)的不同突變型和野生型，并且達(dá)到較高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，經(jīng)Sanger 法測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果完全一致。與傳統(tǒng)的基因分型方法相比，HRM-Idaho LightScanner 分析方法具有高通量、高敏感且操作方便等特性，并能夠在前列腺癌和良性前列腺增生患者中達(dá)到較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。對(duì)研究的兩個(gè)SNP分型結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，風(fēng)險(xiǎn)等位基因rs2066882-A 的攜帶可增加BPH 和PCA 的風(fēng)險(xiǎn)。

1 Hedditch E L，Gao B，Russell A J，et al.ABCA Transporter Gene Expression and Poor Outcome in Epithelial Ovarian Cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2014，106(7):dju149.

2 Van Eck M.ATP-binding cassette transporter A1:key player in cardiovascular and metabolic disease at local and systemic level［J］.Curr Opin Lipidol，2014.

3 Xu Y，Liu Q，Xu Y，et al.Rutaecarpine suppresses atherosclerosis in ApoE-/-mice through up-regulating ABCA1 and SR-BI within RCT［J］.J Lipid Res，2014，jun 7.

4 Lee B.H，Taylor M G，Robinet P，et al.Dysregulation of cholesterol homeostasis in human prostate cancer through loss of ABCA1［J］.Cancer Res，2013，73(3):1211-1218.

5 Ban，J.Y，K.H.Yoo.Promoter Polymorphism (rs12770170，-184C/T)of Microseminoprotein，Beta as a Risk Factor for Benign Prostatic Hyperplasia in Korean Population［J］.Int Neurourol J，2014，18(2):63-67.

6 孫亮，王曉霞，史曉紅，等.應(yīng)用基于HRM 的LunaProbe 技術(shù)檢測(cè)2 型糖尿病易感基因FTO 的三個(gè)變異位點(diǎn)［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23(03):529-531.

7 Ganopoulos P，Pozo P，Zambounis A，et al.High-resolution melting analysis allowed fast and accurate closed-tube genotyping of Fusarium oxysporum formae specials complex［J］.FEMS Microbiol Lett，2012，334(1):16-21.