大鼠血漿中枸杞多糖熒光標記物定量分析方法的建立

陳 忱，唐華麗，馬 月，王少康，楊立剛，彭 景，孫桂菊,*

（1.東南大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，教育部環(huán)境醫(yī)學工程重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.無錫工藝職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 無錫 214200；3.重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶 404000；4.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225000）

大鼠血漿中枸杞多糖熒光標記物定量分析方法的建立

陳 忱1,2，唐華麗1,3，馬 月1，王少康1，楊立剛1，彭 景4，孫桂菊1,*

（1.東南大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，教育部環(huán)境醫(yī)學工程重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.無錫工藝職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 無錫 214200；3.重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶 404000；4.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225000）

建立大鼠血漿中異硫氰酸熒光素標記的枸杞多糖（fluorescein isothiocyanate labeled Lycium barbarum polysaccharides，LBP-FITC）的熒光定量分析方法，線性方程為y=1 378.7x—14.98（R2=0.998 9），血漿中LBP-FITC質(zhì)量濃度在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強度呈良好的線性關(guān)系。方法的精密度、回收率以及穩(wěn)定性考察分析證明該方法符合生物樣品體內(nèi)定量分析的要求。單次灌胃給予大鼠LBP-FITC后，以藥代動力學WinNonlin軟件采用非房室模型擬合大鼠單次口服LBP-FITC的經(jīng)時血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)，計算主要的藥代動力學參數(shù)為最大峰質(zhì)量濃度（Cmax）（2.39±0.71） μg/mL、達峰時間（tmax）（1.17±0. 41） h；藥時曲線下面積AUC0-t為（45.85±7.12）（μg?h）/mL，AUC0-∞為（127.31±39.00）（μg?h）/mL；半衰期（t1/2）為（80.32±32.70） h；清除率為（1 693.96±492.47）mL/kg；平均滯留時間為（20.64±1.36） h。

異硫氰酸熒光素標記的枸杞多糖；藥代動力學；穩(wěn)定性；回收率

藥物代謝動力學的研究是生物活性物質(zhì)研究的一項重要內(nèi)容，其運用數(shù)學原理和方法闡述藥物在機體內(nèi)的動態(tài)規(guī)律，主要研究被測對象在生物體內(nèi)的過程，包括吸收、分布、代謝和排泄[1]。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞發(fā)揮功效的重要成分，體內(nèi)外實驗證實LBP具有多種功效，例如抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化等[2-6]。但作用機理目前研究并不深入，尤其是與功效學研究相比，LBP的代謝動力學研究鮮見報道。LBP是一種蛋白多糖，易溶于水，但是其沒有光吸收基團和發(fā)色基團，不能采用光譜法或色譜法進行直接檢測。本實驗組通過異硫氰酸熒光素（fl uorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）與LBP的共價偶聯(lián)，實現(xiàn)對枸杞多糖的熒光標記，成功制備得到熒光探針LBP-FITC，并且標記產(chǎn)物具有良好的體外穩(wěn)定性，因此可通過測定其熒光強度對其進行定量分析，從而克服了LBP難以進行高靈敏度檢測的困難[7]。有研究發(fā)現(xiàn)該標記方法對多糖生物活性影響較小，對細胞不產(chǎn)生毒性[8-9]。

本實驗建立了大鼠血漿中LBP-FITC的定量分析方法，應(yīng)用已建立的定量分析方法對LBP-FITC 單次口服給藥的大鼠代謝動力學進行研究，以期為多糖的功效機制研究提供良好的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、實驗動物與試劑

枸杞購自寧夏銀川市場。

清潔級SD雄性大鼠（體質(zhì)量200～250 g，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0006） 上海杰思捷實驗動物有限公司。

FITC 美國Sigma公司；單糖標準品為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L-550離心機 湖南離心機儀器有限公司；電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Mithras LB 940多功能酶標儀 德國Berthold公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的提取與熒光標記

本研究的LBP采用膜分離技術(shù)提取，Sevag法脫蛋白[10]，純化得到的多糖。紫外和紅外光譜分析證明LBP是一種與蛋白結(jié)合的復(fù)合多糖，存在β-D型吡喃糖和α-異構(gòu)體吡喃糖。離子色譜分析發(fā)現(xiàn)LBP中單糖含量最高的是葡萄糖，其次是阿拉伯糖和半乳糖。LBP熒光標記參照文獻[11]報道，主要過程為將制備的LBP溶于水中，0.5 mol/mL NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入FITC，室溫避光攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液采用中速定性濾紙過濾，向濾液中加入無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為80%，沉淀析出，離心棄去上清液。沉淀加水復(fù)溶，無水乙醇再沉淀，反復(fù)3 次。再將沉淀用無水乙醇反復(fù)洗滌，直至上清液無熒光吸收后，凍干沉淀得LBP-FITC。

1.3.2 實驗動物

體質(zhì)量200～250 g SD雄性大鼠飼養(yǎng)于東南大學公共衛(wèi)生學院動物實驗室，期間提供標準動物飼料，自由飲水進食。符合衛(wèi)生部頒布的《衛(wèi)生部醫(yī)學實驗動物管理實施細則》和《實驗動物管理條例》的規(guī)定。

1.3.3 實驗設(shè)計

1.3.3.1 LBP-FITC在大鼠血漿中的定量分析方法研究

參考其他方法[12-13]對血漿中LBP-FITC進行定量分析。

LBP-FITC標準貯備液的配制：精確稱取LBP-FITC樣品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，配制成1 mg/mL的LBP-FITC標準貯備液，于4 ℃條件下保存。

LBP-FITC標準系列溶液的配制：臨用時精密量取貯備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL的LBP-FITC標準系列溶液。

1.3.3.2 實驗動物處理

實驗前大鼠自由攝食和飲水，在適應(yīng)環(huán)境3 d后進行實驗。通過股動脈取血，血樣放入EDTA處理過的管中，在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液獲得空白血漿，置于EP管中可立即使用或置于—70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 樣品測定LBP-FITC的測定

采用多功能酶標儀，在熒光激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長520 nm條件下測定其熒光強度。取大鼠血漿150 μL至黑色酶標板中測定熒光強度。

1.3.3.4 標準曲線的繪制

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入30 μL不同質(zhì)量濃度的LBP-FITC標準系列溶液，配制成相當于質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的血漿樣品，同時制備同體積的磷酸緩沖液代替LBP-FITC標準溶液用以測定空白血漿樣品，之后按照1.3.3.3節(jié)操作。以血漿中待測樣品LBP-FITC的質(zhì)量濃度為橫坐標，測定的熒光強度扣除空白血漿的熒光強度為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，所得的直線回歸方程即為標準曲線。

1.3.3.5 方法的精密度考察

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質(zhì)量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，每一質(zhì)量濃度進行5 樣本分析。按照1.3.3.3節(jié)操作，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應(yīng)的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質(zhì)量濃度，與配制的質(zhì)量濃度進行對照求得方法的精密度。在同一天內(nèi)重復(fù)測定5 次，連續(xù)測定5 d，以計算日內(nèi)和日間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3.6 方法的回收率考察

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質(zhì)量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質(zhì)量濃度的QC樣品，每一質(zhì)量濃度進行5 樣本分析。按照1.3.3.3節(jié)操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應(yīng)的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質(zhì)量濃度，與配制的質(zhì)量濃度對照求得方法的回收率。相對回收率的計算見以下公式：

1.3.3.7 方法的穩(wěn)定性考察

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質(zhì)量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質(zhì)量濃度的QC樣品，反復(fù)凍融3 次（—20～25 ℃），每一質(zhì)量濃度進行5 樣本分析，按照1.3.3.3節(jié)操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應(yīng)的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質(zhì)量濃度，計算RSD，考察樣品在反復(fù)凍融3 次后的穩(wěn)定性。

另取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質(zhì)量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質(zhì)量濃度的QC樣品，每一質(zhì)量濃度進行5 樣本分析，于室溫（25 ℃）條件下放置24 h，按照1.3.3.3節(jié)操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應(yīng)的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質(zhì)量濃度，計算RSD，考察樣品在室溫（25 ℃）情況下放置24 h后的穩(wěn)定性。

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質(zhì)量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質(zhì)量濃度的QC樣品，每一質(zhì)量濃度進行5 樣本分析，于—20 ℃條件下貯存15 d后取樣，迅速融化，按照1.3.3.3節(jié)操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應(yīng)的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質(zhì)量濃度，計算RSD，考察樣品在—20 ℃冷凍條件下貯存半個月后的穩(wěn)定性。

1.3.3.8 單次口服LBP-FITC的大鼠代謝動力學研究

健康雄性SD大鼠（200～250 g）6 只，在適應(yīng)環(huán)境3 d后進行實驗。給藥前禁食12 h，自由飲水，經(jīng)口服灌胃給予LBP-FITC，給藥劑量200 mg/kg（以體質(zhì)量計），給藥容量1 mL/100 g。分別于灌胃給藥前及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h尾靜脈取血0.5 mL。將血樣采集到抗凝離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液得到血漿，按1.3.3.3節(jié)條件測定熒光強度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用藥代動力學WinNonlin軟件，采用非房室模型擬合大鼠單次口服LBP-FITC的經(jīng)時血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)，最大峰質(zhì)量濃度（Cmax）及達峰時間（tmax）為實測值；藥時曲線下面積（area under the curve，AUC）、半衰期（t1/2）、總清除率（clearance，CL）、表觀分布容積（Vd）、平均滯留時間（mean residence time，MRT）等用統(tǒng)計矩參數(shù)。AUC反映藥物進入血循環(huán)的總量；t1/2表示藥物在體內(nèi)分布達到平衡后，血漿藥物質(zhì)量濃度消除一半所需的時間，是表達藥物在體內(nèi)消除快慢的重要參數(shù)；CL表示單位時間內(nèi)有多少分布容積中的藥物被清除，是估算藥物從體內(nèi)消除速度的參數(shù)；MRT是指藥物分子滯留在體內(nèi)的平均時間；Vd值表征藥物在體內(nèi)被組織攝取的能力，表觀容積大的藥物體內(nèi)存留時間較長。

2 結(jié)果與分析

2.1 血藥質(zhì)量濃度標準曲線

所得線性回歸方程為y=1 378.7x—14.98（R2=0.998 9），血漿中LBP-FITC質(zhì)量濃度在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強度線性關(guān)系良好，線性方程滿足代謝動力學的研究要求。

2.2 血漿精密度

表 1 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的日內(nèi)精密度（n=5）Table 1 Inter-day precision of LBP-FITC in blank rat plasma ( n= 5)

表 2 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的日間精密度（n=5）Table 2 Intra-day precision of LBP-FITC in blank rat plasma (n= 5)

由表1、2可知，大鼠血漿中LBP-FITC質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的5 個樣品日內(nèi)RSD分別為5.28%、6.90%、3.17%、4.68%、4.90%，日間RSD為4.15%；質(zhì)量濃度為1 μg/mL的日內(nèi)RSD分別為6.41%、5.01%、4.91%、2.67%、5.39%；日間RSD為3.13%；質(zhì)量濃度為10 μg/mL的日內(nèi)RSD分別為3.86%、2.24%、3.28%、 2.48%、1.97%，日間RSD為2.62%。組內(nèi)和組間的RSD都較小，證明該方法具有較好的精密度。

2.3 血漿回收率

表 3 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的回收率（n=5）Table 3 Recovery of LBP-FITC in rat plasma (n=5)

由表3可知，回收率在93.37%～95.72%之間，RSD分別為3.44%～4.62%，表明該方法具有良好回收率。

2.4 血漿穩(wěn)定性

樣品在室溫放置24 h、反復(fù)凍融3 次和凍存15 d后的穩(wěn)定性測定結(jié)果見表4，顯示RSD均較小，不大于5%，故含藥血漿在室溫條件下存放24 h、反復(fù)凍融3 次以及—20 ℃條件下貯存15 d的穩(wěn)定性均良好。

表 4 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的穩(wěn)定性結(jié)果（n=5）Table 4 Stability of LBP-FITC in rat plasma (n = 5)

2.5 大鼠單次口服LBP-FITC血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

圖 1 大鼠單次口服LBP-FITC的血藥質(zhì)量濃度-時間曲線Fig.1 Plasma concentration-time profi le of LBP-FITC after oral administration

大鼠單次灌胃給予200 mg/kg LBP-FITC后，以測定的血漿藥物質(zhì)量濃度對所對應(yīng)的采血點作圖，獲得血藥質(zhì)量濃度-時間曲線圖，見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在灌胃后0.5 h就可在大鼠血漿中檢測出一定的熒光強度，表明0.5 h時LBP已吸收進入血液，1～2 h達到吸收高峰，之后隨著時間的延長血藥質(zhì)量濃度逐漸減少，且速率逐漸減緩，直至48 h時仍能在血漿中測到熒光強度。

2.6 大鼠單次口服LBP-FITC的血漿藥代動力學參數(shù)

利用藥代動力學WinNonlin軟件，采用非房室模型擬合大鼠單次口服LBP-FITC的經(jīng)時血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)，計算得到主要藥代動力學參數(shù)見表5。

表 5 大鼠單次口服LBP-FITC的主要藥代動力學參數(shù)Table 5 Non-compartmental pharmacokinetic parameters of LBP-FITC after oral administration

如表5 所示，6 只動物的最大血藥質(zhì)量濃度Cmax為（2.39±0.71） μg/mL；最大峰時間tmax為（1.17±0.41）h；AUC0-t為（45.85±7.12）（μg·h）/mL；AUC0-∞為（127.31±39.00）（μg·h）/mL；t1/2為（80.32±32. 70） h；CL為（1693.96±492.47） mL/kg；MRT為（20.64±1.36）h。

本研究中Cmax和t1/2值可說明LBP-FITC在大鼠體內(nèi)的吸收迅速，但是消除緩慢，這可能與其高分子的性質(zhì)有關(guān)。

3 討 論

近年來，天然多糖的研究越來越受到人們的重視，但是多糖在體內(nèi)的代謝過程一直是人們所面臨的困惑。研究表明多糖可以以大分子形式吸收，但吸收率不高，有學者推測在大腸可能有部分多糖的代謝物-寡糖類被吸收，發(fā)揮吸收作用，產(chǎn)生類似與多糖的藥理作用，而剩余部分經(jīng)大腸排泄[14]。但是多糖吸收后以何種方式存在，又是以什么形式發(fā)揮多重功效的，尚未有文章報道。代謝動力學研究可以揭示多糖在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄的規(guī)律，并且也是闡明多糖及其代謝產(chǎn)物的藥理和毒理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者也開始嘗試將同位素標記方法運用到多糖類物質(zhì)的代謝動力學研究當中。謝炳華等[16]采用氚離子束標記茯苓聚糖，并口服灌胃小鼠以研究其在體內(nèi)的藥代動力學。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物質(zhì)量濃度-時間曲線屬于動力學雙室模型，消除半衰期較長（104 h），這可能是由于其高分子的性質(zhì)所決定的。O′har[17]采用同位素標記法制備3H-香菇多糖，研究其在大鼠、小鼠和狗體內(nèi)的藥代動力學。結(jié)果顯示，3H-香菇多糖在大鼠、小鼠和狗體內(nèi)的分布沒有明顯區(qū)別，單次靜脈注射后血漿中的放射性強度逐漸減少，尿液和糞便中均能檢測出放射性；在肝臟和脾臟中也能檢測出放射性物質(zhì)，但另一方面，腎臟和肺中的放射性強度迅速下降。陳群等[18]利用天青A與硫酸化多糖產(chǎn)生變色反應(yīng)的特性，建立了大鼠血漿中茯苓多糖硫酸酯（pachyman sulfate，PS）的光譜檢測方法，同時測定了大鼠尾靜脈注射和腹腔注射PS后的血藥質(zhì)量濃度，計算主要藥代動力學參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PS的藥代動力學復(fù)合一房室、一級消除的開放模型，生物利用度為69.12%。

多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺少可見光、紫外光和熒光等光譜特征，體外檢測多是采用連接熒光檢測器或者蒸發(fā)光散射檢測器的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法。但是由于體液成分較為復(fù)雜，使用HPLC方法時需要先進行去蛋白處理，易破壞多糖的結(jié)構(gòu)，影響檢測效果，并且操作要求高，設(shè)備價格昂貴，因此同位素標記法進行多糖代謝研究結(jié)果有片面性和困難性[19]。有學者開始嘗試熒光標記多糖用于多糖代謝研究中。胡錦珍等[20]采用FITC對殼聚糖進行熒光標記得到產(chǎn)物為FITC-CIS，采用熒光分光光度計測定和HPLC分析相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)小鼠口服FITC-CIS后主要分布在腎臟中，并以原型形式經(jīng)糞便排出，部分分解的殼聚糖則從尿液排出，但是血清中的FITC-CIS質(zhì)量濃度非常低，可能是具有較高分子質(zhì)量的殼聚糖很難被吸收進入血液的緣故。謝華通等[21-22]同樣采用FITC標記麥冬多糖MDG-1得到F-MDG-1，采用熒光凝膠色譜法觀察多糖在大鼠胃腸道內(nèi)的含量變化以及排泄變化。結(jié)果顯示，給予相同劑量的F-MDG-1，隨著在胃內(nèi)停留時間的延長，其質(zhì)量分數(shù)由99.65%下降到42.45%；給予不同劑量后，1 h的測得質(zhì)量分數(shù)占給藥量的百分比隨著給藥劑量的增加而增加，考慮到胃酸的酸性pH值影響熒光響應(yīng)值，將pH值調(diào)至7.2后含量并未變化，提示F-MDG-1在胃內(nèi)不受環(huán)境以及蛋白酶的影響，在胃內(nèi)不被分解。4 h后大腸和小腸中的測得量均有減少，數(shù)據(jù)結(jié)果表明MDG-1在腸道內(nèi)分解，主要代謝部位在大腸。尿液和糞便中測定均在12 h時達到最大值，隨后逐漸減少。

本實驗采用熒光酶標儀測定血漿中的LBP-FITC的熒光強度以計算其中的藥物質(zhì)量濃度。相比較于熒光分光光度計，熒光酶標儀檢測方法對生物樣品需求量少，僅需100～200 μL即可進行測定，節(jié)省生物樣品，且可同時測定多個樣品，操作方便。

目前對于方法學的考察確證主要包括對方法的選擇性、線性及范圍、精密度、回收率和樣品穩(wěn)定性等方面的考察，要求測定5～8 個系列質(zhì)量濃度的生物樣品來繪制標準曲線，并且標準曲線要覆蓋待測樣品的質(zhì)量濃度范圍。另外樣品從采集到分析這一過程需經(jīng)過很多步驟，保證樣品的穩(wěn)定性是定量分析可靠的一個必要條件，因此在分析方法的建立過程中應(yīng)充分了解樣品在分析操作過程中的穩(wěn)定性。文獻[23]認為應(yīng)首先考慮被測物在儲存條件下的可穩(wěn)定性時間，其次考慮被測物在生物樣品中的穩(wěn)定性，包括在室溫、冷凍貯存和反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性。故本研究對所建立的方法進行了線性、精密度、回收率及穩(wěn)定性的考察，結(jié)果表明該檢測方法線性范圍較寬、靈敏度高、重復(fù)性好，生物樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)對測定不產(chǎn)生干擾，符合藥代動力學研究的指導(dǎo)原則以及生物樣品分析國際規(guī)范的相關(guān)要求，為進一步的多糖代謝動力學研究提供良好的檢測方法。

一直以來，由于多糖沒有準確靈敏的檢測方法，所以與藥效學相比，LBP等多糖類的代謝動力學研究鮮未報道。本研究利用已建立的檢測方法對大鼠單次口服LBP-FITC后的血漿代謝動力學進行初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大鼠灌胃給予LBP-FITC后0.5 h就可在血漿中的檢測出一定的熒光強度，說明LBP在大鼠體內(nèi)吸收較快。1～2 h達到吸收最大峰，之后隨著時間的延長血藥質(zhì)量濃度逐漸減少，直至48 h時仍能在血漿中測到熒光強度。

本實驗建立了一種準確、靈敏且快速簡便的測定大鼠血漿中LBP-FITC的熒光檢測法，并應(yīng)用該方法對大鼠單次口服LBP-FITC的大鼠代謝動力學展開了研究，可為以后多糖的功效機制研究提供良好的依據(jù)。

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Establishment of A Method for Detecting Fluorescence Labeled Lycium barbarum Polysaccharide in Rat Plasma

CHEN Chen1,2, TANG Huali1,3, MA Yue1, WANG Shaokang1, YANG Ligang1, PENG Jing4, SUN Guiju1,*
(1. Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering, Ministry of Education, Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Wuxi Institute of Arts and Technology, Wuxi 214200, China; 3. College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404000, China; 4. Tourism Institute, Yangzhou University, Yangzhou 225000, China)

A rapid and sensitive fl uorescent method was developed to determine fl uorescein isothiocyanate-labeled Lycium barbarum polysaccharides (LBP-FITC) in rat plasma. The linear calibration curve was obtained in the range from 0.05 to 10 μg/mL in rat plasma and the linear equation was y = 1 378.7x-14.98 (R2= 0.998 9). The inter-day coefficients of variation (CVs) at 0.1, 1.0 and 10 μg/mL of LBP-FITC were between 1.97% and 6.90%, and the intraday CVs at the three concentrations were between 2.62% and 4.15%. The recovery rates of LBP-FITC in rat plasma wer e between 93.37% and 95.72%. LBP-FITC was stable in rat plasma. The established method is suitable for LBP-FITC pharmacokinetic study. After oral administration of LBP-FITC to rats, the non-compartmental model was used to calculate the main pharmacokinetic parameters by WinNonlin software. The results of pharmacokinetic parameters indicated that the peak concentration (Cmax) was (2.39 ± 0.71) μg/mL, the time to reach the peak value (tmax) was (1.17 ± 0.41) h, the area under the curve (AUC0-t) was (45.85 ± 7.12) (μg·h)/mL, the AUC0-∞was (127.31 ± 39.00) (μg·h)/mL, the t1/2was (80.32 ± 32.70) h, the clearance (CL) was (1 693.96 ± 492.47) mL/kg, and the mean retention time (MRT) was (20.64 ± 1.36) h.

fl uorescein isothiocyanate-labeled Lycium barbarum polysaccharides (LBP-FITC); pharmacokinetics; stability; recovery rate

R151.3

A

1002-6630（2015）02-0090-06

10.7506/spkx1002-6630-201502017

2014-06-20

國家自然科學基金面上項目（81273069）；國家大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目（1310286097）；

江蘇省高等學校大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目（S2014116）

陳忱（1989—），女，助教，碩士研究生，研究方向為植物化學物與食品功效。E-mail：chen_chen0214@163.com

*通信作者：孫桂菊（1963—），女，教授，博士，研究方向為植物化學物與食品功效。E-mail：gjsun@seu.edu.cn