樹脂對(duì)普洱茶多糖的純化與分離

楊新河，黃建安，劉仲華,*，毛清黎

（1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

樹脂對(duì)普洱茶多糖的純化與分離

楊新河1,2，黃建安2，劉仲華1,2,*，毛清黎1,2

（1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

研究10 種樹脂對(duì)普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果及DEAE-52纖維素離子交換樹脂對(duì)普洱茶多糖的分離效果。結(jié)果表明，D101樹脂適合于對(duì)普洱茶多糖同時(shí)脫色和蛋白質(zhì)去除，當(dāng)普洱茶多糖溶液體積為50 mL時(shí)，在pH 4、溫度50 ℃、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL、樹脂用量11 mL的條件下，普洱茶 多糖的脫色率為82.33%、蛋白質(zhì)去除率為70.89%。DEAE-52纖維素離子交換樹脂分離經(jīng)D101樹脂處理的普 洱茶多糖能得到6 個(gè)不同多糖級(jí)分。

樹脂；普洱茶；多糖；純化；分離

普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)過后發(fā)酵加工成的散茶和緊壓茶。研究表明，普洱茶具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗突變、防癌等功能[1-7]，而茶多糖是其藥理作用的主要成分之一[8-13]。目前，普洱茶多糖的研究?jī)H停留在粗茶多糖層面，幾乎不能確定其結(jié)構(gòu)特征和評(píng)價(jià)其確切功效，因而開展普洱茶多糖的分離對(duì)深入進(jìn)行普洱茶多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究具有極其重要的意義。

目前，茶多糖的分離研究涉及到脫色、蛋白質(zhì)去除和分級(jí)等方面。常用的多糖脫色方法有活性炭法、過氧化氫法和十六烷基三甲基溴化銨-正己醇-異辛烷法；蛋白質(zhì)去除技術(shù)有鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和酶解法[14]；常見的分級(jí)方法有沉淀法、超濾法和柱層析法[15-18]。其中脫色和蛋白質(zhì)去除的上述方法均存在一些不足，如引起多糖的降解與結(jié)構(gòu)破壞、有機(jī)溶劑殘留及效率低等，并且脫色和蛋白質(zhì)去除分為兩步進(jìn)行時(shí)工序繁鎖、多糖損失嚴(yán)重。而大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，主要應(yīng)用于環(huán)保、醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。其中，大孔樹脂已用于多種植物多糖脫色[19-23]，但大孔樹脂同時(shí)脫除粗多糖中的色素和蛋白質(zhì)的研究很少報(bào)道。本研 究探討大孔樹脂對(duì)普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果，并采用兼有脫色功能的DEAE-52纖維素離子交換樹脂對(duì)普洱茶多糖進(jìn)行分級(jí)，旨在為研究普洱茶多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性奠定基礎(chǔ)，也為研究其他富含多酚類化合物的植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵后提取的多糖脫色及蛋白質(zhì)去除提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍潤(rùn)普洱茶（2007年） 云南龍潤(rùn)茶業(yè)集團(tuán)；AB-8、S-8、NKA-9、D201×4及001×7樹脂 南開大學(xué)化工廠；聚酰胺 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；LSA-7樹脂 西安藍(lán)曉科技有限公司；D101樹脂 天津農(nóng)藥廠；XAD-7HP和HP-20樹脂 日本三菱樹脂株式會(huì)社；纖維素DEAE-52陰離子交換樹脂 英國(guó)Whatman公司；D32透析袋 美國(guó)Bromma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3TC型酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司；SKY-200B型恒溫培養(yǎng)震蕩器 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；Rotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Büchi公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHIMADZU UV-2550型紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；SMY-2000ST測(cè)色色差計(jì) 北京盛名揚(yáng)科技開發(fā)有限責(zé)任公司；LD4-2A型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；DHL-A電腦恒流泵、SZ-100自動(dòng)收集器 上海滬西儀器廠；玻璃層析柱 長(zhǎng)沙匯虹玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

工藝流程：陰（陽(yáng)）離子交換樹脂→95%乙醇浸泡12 h→蒸餾水洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁→4% NaOH溶液（5% HCl溶液）浸泡4 h→蒸餾水洗至中性→5% HCl溶液（4% NaOH溶液）浸泡4 h→蒸餾水洗至中性。

吸附樹脂的預(yù)處理與陽(yáng)離子交換樹脂相同。

1.3.2 樣品制備

稱取一定質(zhì)量經(jīng)石油醚脫脂的普洱茶干燥粉碎樣，放置浸提瓶中，加入25倍質(zhì)量的蒸餾水，在90 ℃水浴鍋中浸提70 min，過濾，濾液濃縮至一定體積，加入95%乙醇使最終醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃冰箱中靜置12 h后以4 000 r/min離心10 min，取沉淀加適當(dāng)水溶解，真空濃縮至無(wú)醇味，備用。

1.3.3 靜態(tài)吸附操作方法

量取5 mL經(jīng)預(yù)處理的離子交換樹脂或吸附樹脂于250 mL三角瓶中，分別加入50 mL相同的普洱茶多糖溶液，30℃恒溫振搖24 h，振搖頻率120 r/min。振搖結(jié)束后，用濾紙過濾的方法將樹脂和茶多糖溶液分離，濾液定容至100 mL并調(diào)至與原多糖溶液相同的pH值，然后測(cè)定溶液與蒸餾水的總色差ΔE與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，計(jì)算脫色率與蛋白質(zhì)去除率。

1.3.4 動(dòng)態(tài)吸附操作方法

取3 根玻璃層析柱，分別裝入經(jīng)預(yù)處理的D101、HP-20及AB-8樹脂70 mL，按照2 BV/h流速各加入與靜態(tài)吸附相同的茶多糖溶液280 mL，按照0.5 BV/管收集并測(cè)定每管溶液與蒸餾水的總色差ΔE*，按照式（1）計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附率。上樣完畢，關(guān)閉柱子下端活塞0.5 h，接著用2 BV蒸餾水以2 BV/h的流速洗脫，合并水洗脫液與上樣收集的流出液，測(cè)定溶液與蒸餾水的總色差ΔE與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，計(jì)算脫色率與蛋白質(zhì)去除率。

1.3.5 D101樹脂靜態(tài)吸附色素的曲線

量取5 mL經(jīng)預(yù)處理的D101樹脂于250 mL三角瓶中，加入50 mL普洱茶多糖溶液，恒溫振搖，振搖轉(zhuǎn)速120 r/min。每小時(shí)取1 mL溶液用于測(cè)定與蒸餾水的總色差ΔE，同時(shí)補(bǔ)充1 mL原液于三角瓶中，計(jì)算樹脂吸附不同時(shí)間的脫色率。

1.3.6 D101樹脂靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 溫度對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響量取5 份經(jīng)預(yù)處理的樹脂5 mL，各加入相同質(zhì)量濃度的茶多糖溶液50 mL，溫度分別設(shè)為20、30、40、50、60 ℃，恒溫振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照

1.3.3 節(jié)方法操作。

1.3.6.2 樹脂用量對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響

分別量取經(jīng)預(yù)處理的樹脂3、5、7、9、11 mL，加入相同質(zhì)量濃度的多糖溶液50 mL，50℃振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照1.3.3節(jié)方法操作。

1.3.6.3 pH值對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響

量取5 份經(jīng)預(yù)處理的樹脂7 mL，分別加入預(yù)先調(diào)節(jié)好pH值為4.0、4.6、5.2、5.8、6.4的相同質(zhì)量濃度的多糖溶液50 mL，50 ℃振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照1.3.3節(jié)方法操作。

1.3.6.4 料液質(zhì)量濃度對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響

量取5 份經(jīng)預(yù)處理的樹脂7 mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.24、0.48、0.95、1.90、3.80 mg/mL多糖及pH 5.2的溶液50 mL，50℃振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照1.3.3節(jié)方法操作。

1.3.7 D101樹脂靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定溫度、樹脂用量、pH值及料液質(zhì)量濃度四因素的水平見表1，進(jìn)行正交試驗(yàn)全面考察4 個(gè)因素對(duì)D101樹脂脫除普洱茶多糖溶液中色素和蛋白質(zhì)的影響，優(yōu)化參數(shù)。

表 1 D101樹脂靜態(tài)吸附因素水平表Table 1 Variables and levels used in orthogonal array design for static adsorption of D101 resin

1.3.8 分析及計(jì)算方法

1.3.8.1 蛋白質(zhì)測(cè)定及蛋白質(zhì)去除率計(jì)算

蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[24]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸方程為ρ=231.35A—11.396，相關(guān)系數(shù)r=0.996 4，其中，ρ為以牛血清白蛋白計(jì)的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；A為吸光度。

式中：ρ前、ρ后分別為脫色前和脫色后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.8.2 色差值測(cè)定及脫色率計(jì)算[25]

調(diào)整待測(cè)茶多糖溶液pH值，用蒸餾水稀釋4倍，測(cè)定與蒸餾水的總色差ΔE。

式中：ΔE前、ΔE后分別為脫色前、后溶液與蒸餾水的總色差值。

1.3.9 DEAE-52柱層析分離普洱茶茶多糖

準(zhǔn)確稱取經(jīng)D101樹脂脫色和脫蛋白質(zhì)的多糖樣品2g，溶于20mL蒸餾水中，上DEAE-52柱（有效柱體積為120 mL），依次用1BV蒸餾水及0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液洗脫，控制流速為0.1 BV/h，按照5 mL/管收集并測(cè)定每管在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，然后將樣品溶液按1∶5稀釋后用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖的含量。以苯酚-硫酸法檢測(cè)280 nm波長(zhǎng)處多糖的吸光度為縱坐標(biāo)，以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)作DEAE-52色譜柱洗脫曲線圖。分別合并各主峰溶液，減壓濃縮至一定體積后用流水透析48 h，然后減壓濃縮透析袋內(nèi)的多糖溶液，冷凍干燥得到多糖級(jí)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的初步篩選

圖 1 樹脂靜態(tài)吸附對(duì)茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果Fig.1 Effect of static adsorption by different types of resins on decolorization and deproteinization

由圖1可知，10 種樹脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的吸附各不相同，其中D101、S-8、HP-20及AB-8樹脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的吸附能力較強(qiáng)，均能去除普洱茶多糖中60%以上的色素和50%以上的蛋白質(zhì)，而其余6種樹脂的色素脫除率和蛋白質(zhì)去除率均低于50%。這10種樹脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)去除能力的差異受到樹脂的極性、比表面積、孔體積和平均孔徑、以及普洱茶多糖、蛋白質(zhì)和色素的相對(duì)分子質(zhì)量與極性等多重因素的綜合影響。圖1還表明，001×7陽(yáng)離子交換樹脂不但沒有脫色效果，反而使普洱茶多糖的顏色加深，可能的原因是001×7陽(yáng)離子交換樹脂與普洱茶多糖溶液中的物質(zhì)交換基團(tuán)后引起pH值的變化，促使更多的多酚氧化聚合成顏色較深的物質(zhì)。

吸附后的樹脂用80%酒精解吸4 h，經(jīng)測(cè)定樹脂解吸前、后吸附固形物質(zhì)量后計(jì)算發(fā)現(xiàn)S-8吸附固形物的解吸率遠(yuǎn)低于D101、HP-20和AB-8樹脂的解吸率，僅為 11.50%。由于S-8為極性樹脂，比表面積僅為100～200 m2/g， D101和HP-20樹脂均為非極性樹脂，比表面積分別為500～600 m2/g和600 m2/g，AB-8為弱極性樹脂，比表面積為480～520 m2/g，因而初步推測(cè)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的極性很強(qiáng)，能牢固地吸附在S-8樹脂上而不易被洗脫釋放出來(lái)，進(jìn)而表明S-8樹脂再生十分困難，不宜用于普洱茶多糖的脫色和蛋白質(zhì)去除。因此，選擇D101、AB-8及HP-20作進(jìn)一步篩選。

2.2 3 種樹脂對(duì)茶多糖溶液中色素的動(dòng)態(tài)吸附率

圖 2 3 種樹脂動(dòng)態(tài)吸附茶多糖溶液中色素的效果Fig.2 Dynamic adsorption of pigments present in tea polysaccharide by three types of resins

由圖2可知，D101、AB-8及HP-20樹脂動(dòng)態(tài)吸附普洱茶多糖溶液中的色素均隨上樣液體積的增加而呈現(xiàn)吸附能力下降的趨勢(shì)。其中第2管與第1管相比，吸附色素的能力下降十分明顯，D101、AB-8和HP-20分別下降了23.98%、28.38%和 24.24%，并且第2管的流出液中就含有較高的色素；從第3管開始，3種樹脂對(duì)色素的吸附率都低于70%；第6管時(shí)樹脂對(duì)色素的吸附率均不到60%。由此表明，樹脂動(dòng)態(tài)吸附普洱茶多糖溶液中色素的效果欠佳。

由圖3與圖1可知，D101、AB-8和HP-20處理4 倍樹脂體積的普洱茶多糖溶液時(shí)脫色率和蛋白質(zhì)去除率低且效果均不及靜態(tài)吸附法處理10 倍樹脂體積的普洱茶多糖溶液。依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推理，3 種樹脂采用動(dòng)態(tài)吸附法分別處理10 倍樹脂體積料液，則對(duì)多糖溶液脫色和蛋白質(zhì)去除效果將遠(yuǎn)不及靜態(tài)吸附法。綜合考慮，選擇D101樹脂采用靜態(tài)吸附法來(lái)脫除普洱茶多糖溶液中的色素與蛋白質(zhì)。

圖 3 3 種樹脂對(duì)茶多糖溶液動(dòng)態(tài)脫色和蛋白質(zhì)去除的效果Fig.3 Effects of three types of resins on dynamic decolorization and deproteinization of tea polysaccharides

2.3 D101樹脂靜態(tài)吸附色素的曲線

圖 4 D101樹脂靜態(tài)吸附色素的曲線Fig.4 Static adsorption curve of D101 resin for pigments

由圖4可知，D101樹脂對(duì)普洱茶多糖中色素的脫除率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。當(dāng)脫色時(shí)間在1～3 h內(nèi)，脫色效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，但從4 h延長(zhǎng)至7 h，脫色率略有增加，意味著樹脂吸附色素在4～7 h接近飽和。這可能與吸附過程中色素的濃度降低和樹脂的有效吸附面積減少有關(guān)?？紤]到脫色的時(shí)間效率及吸附時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使多糖的保留率偏低，因此，靜態(tài)吸附色素的時(shí)間以5 h為宜。

2.4 D101樹脂靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 溫度對(duì)D101樹脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 5 溫度對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.5 Effect of temperature on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖5，溫度對(duì)普洱茶多糖溶液的脫色和蛋白質(zhì)去除有一定程度的影響。溫度在20～50 ℃范圍內(nèi)，D101樹脂對(duì)茶多糖溶液的脫色率隨溫度的升高而增加，蛋白質(zhì)去除率增加明顯；溫度為50 ℃與60 ℃相比，后者脫色率略高于前者，但蛋白質(zhì)去除率明顯下降?？赡苁钱?dāng)溫度低于50 ℃時(shí)隨溫度升高樹脂功能基團(tuán)活性增強(qiáng)，溶液的黏度下降，色素和蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散速率加快，從而樹脂吸附3 種分子的速率加快；當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)同色素的結(jié)合力減弱，色素競(jìng)爭(zhēng)性被樹脂吸附的能力強(qiáng)于蛋白質(zhì)。綜合考慮脫色率、蛋白質(zhì)去除率和操作溫度的控制，D101樹脂宜在30～50 ℃范圍使用。

2.4.2 樹脂用量對(duì)D101樹脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 6 樹脂用量對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.6 Effects of resin volume on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖6，樹脂用量在3～11 mL范圍內(nèi)時(shí)，D101樹脂對(duì)茶多糖溶液的脫色率及蛋白質(zhì)去除率隨樹脂用量的增加而提高，因?yàn)闃渲昧吭黾酉喈?dāng)于單位體積溶液中用于吸附物質(zhì)的樹脂總表面積增大，樹脂功能基團(tuán)增多，提高了對(duì)色素和蛋白質(zhì)的吸附量。當(dāng)樹脂用量超過11 mL時(shí)，隨樹脂用量的繼續(xù)增加，脫色率和蛋白質(zhì)去除率進(jìn)一步增加的力度小，但會(huì)使多糖的保留率降低。因此，樹脂用量以不超過11 mL為宜。

2.4.3 pH值對(duì)D101樹脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 7 pH值對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.7 Effect of pH on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖7，pH值在4.0～6.4范圍內(nèi)時(shí)，D101樹脂對(duì)普洱茶多糖溶液的脫色率與蛋白質(zhì)去除率隨pH值的降低而明顯升高，因?yàn)閜H值的降低可能有更多的蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)而沉淀析出，同時(shí)會(huì)使離子形式的色素更多地轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑肿有问酱嬖诙欣跇渲奈健拿撋始暗鞍踪|(zhì)去除率的綜合效果來(lái)看，pH值適宜在4.0～5.2范圍內(nèi)。

2.4.4 料液質(zhì)量濃度對(duì)D101樹脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 8 料液質(zhì)量濃度對(duì)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.8 Effect of sample concentration on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖8，多糖質(zhì)量濃度在0.24～1.90 mg/mL范圍內(nèi)，D101樹脂對(duì)普洱茶多糖溶液的脫色率和蛋白質(zhì)去除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高。而料液質(zhì)量濃度1.90 mg/mL與3.80 mg/mL 相比較，前者脫色率略有降低，但蛋白質(zhì)去除率增加了6.55%。從脫色率、蛋白質(zhì)去除率、后續(xù)濃縮工序的能耗及效率等方面綜合評(píng)價(jià)，料液質(zhì)量濃度宜控制在0.95～3.80 mg/mL范圍內(nèi)。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化脫色與蛋白質(zhì)去除的工藝條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)法優(yōu)化普洱茶多糖提取液的最佳脫色和蛋白質(zhì)去除條件，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表 2 普洱茶多糖溶液脫色與脫蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of orthogonal array experiments for the optimization of resin adsorption conditions

由表2極差分析可看出，pH值對(duì)于脫色率的影響較大，樹脂用量次之，料液質(zhì)量濃度對(duì)脫色率影響最小。溫度對(duì)于蛋白質(zhì)去除率的影響較大，樹脂用量次之，pH值對(duì)蛋白質(zhì)去除率影響最小。從數(shù)據(jù)分析確定的脫色和蛋白質(zhì)去除條件相同，即溫度50 ℃、樹脂用量11 mL、pH 4.0、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL。

在此條件下進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，普洱茶多糖溶液的脫色率可達(dá)到82.33%，蛋白質(zhì)去除率為70.89%，優(yōu)于正交組合表中各處理的結(jié)果，證明優(yōu)化的條件是合理的。

2.6 纖維素DEAE-52陰離子交換樹脂分離普洱茶茶多糖

圖 9 普洱茶茶多糖在DEAE-52色譜柱上的洗脫曲線Fig.9 Elution curve of Pu-Erh tea polysaccharide on DEAE-52 column

采用DEAE-52柱層析對(duì)經(jīng)D101樹脂脫色和脫蛋白質(zhì)的茶多糖進(jìn)行分離，依次經(jīng)H2O和0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。從圖9可知，檢測(cè)多糖時(shí)，除了0.1 mol/L NaCl溶液洗脫收集的溶液呈現(xiàn)一個(gè)大峰和一個(gè)小峰有交叉之外（二峰視為單峰收集），其他濃度的洗脫劑均可獲得一單峰。第1個(gè)多糖峰對(duì)應(yīng)的溶液在280 nm波長(zhǎng)處有明顯的吸收峰，意味著該溶液可能含有糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合物，第2、3個(gè)多糖峰對(duì)應(yīng)的溶液在280 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)很小的吸收峰，余下各多糖峰對(duì)應(yīng)的溶液在280 nm波長(zhǎng)處未見吸收峰。合并各主峰對(duì)應(yīng)的收集液，減壓濃縮，透析48 h后袋內(nèi)溶液減壓濃縮，冷凍干燥得到多糖級(jí)分，按照收集的先后順序依次命名為TPSⅠ、TPSⅡ、TPSⅢ、TPSⅣ、TPSⅤ和TPSⅥ。

3 討 論

普洱茶屬于后發(fā)酵茶，多酚氧化程度高，產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素、茶褐素為普洱茶色素。普洱茶中茶色素具有含量高，極性很大且存在部分與多糖及蛋白質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，完全不同于絕大多數(shù)植物多糖提取液中的色素，色素的脫除十分困難。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活性炭對(duì)普洱茶多糖溶液幾乎沒有脫色效果；過氧化氫的脫色率約為45.2%，但考慮到過氧化氫有可能破壞多糖結(jié)構(gòu)及引起普洱茶中簡(jiǎn)單多酚氧化聚合成有顏色的物質(zhì)而未作深入研究；傳統(tǒng)的Sevag法5 次蛋白質(zhì)去除率僅為36.83%；溶液中終質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%胰蛋白酶與Sevag法5 次相結(jié)合時(shí)蛋白質(zhì)去除率為49%。因此，常用的多糖脫色和蛋白質(zhì)去除方法均不適合于普洱茶多糖溶液的直接脫色與蛋白質(zhì)去除。

本研究采用樹脂進(jìn)行普洱茶多糖同步脫色和蛋白質(zhì)去除，與常規(guī)的多糖脫蛋白、脫色方法相比，具有工序少、操作簡(jiǎn)單、溶劑安全、處理量大、周期短等優(yōu)點(diǎn)。夏瑋等[23]用高效凝膠過濾色譜測(cè)定了樹脂對(duì)多糖脫色前后的色譜圖，結(jié)果色譜圖形狀大致相同，只是不同部分峰高有一定程度的降低，樹脂對(duì)不同分子質(zhì)量范圍的多糖都有一定吸附作用，不會(huì)專一性吸附凝膠過濾色譜峰中單峰對(duì)應(yīng)的多糖，也不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)。因此，采用樹脂進(jìn)行普洱茶多糖同步脫色和蛋白質(zhì)去除不僅為后續(xù)研究普洱茶多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)與生物活性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為研究其他植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵后提取的多糖脫色和蛋白質(zhì)去除提供了重要的技術(shù)參考。

此外，用纖維素DEAE-52樹脂分離經(jīng)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的普洱茶多糖，得到6 個(gè)多糖級(jí)分，經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥后根據(jù)顏色深淺和多糖含量高低，可優(yōu)先選擇TPSⅠ和TPSⅡ用于進(jìn)一步分離純化、結(jié)構(gòu)表征與功效研究。本研究還表明D101樹脂對(duì)普洱茶多糖溶液中色素的吸附率高達(dá)82.33%，故可以對(duì)吸附的色素進(jìn)行洗脫收集及進(jìn)一步的分離純化、結(jié)構(gòu)與藥理活性研究，也許將有助于深化茶葉科學(xué)的相關(guān)理論和深度開發(fā)普洱茶色素。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)篩選出D101樹脂適合于對(duì)普洱茶多糖同時(shí)脫色和蛋白質(zhì)去除，并優(yōu)化了其對(duì)普洱茶多糖溶液脫色和蛋白質(zhì)去除的條件：當(dāng)普洱茶多糖溶液體積為50mL時(shí)，溫度50 ℃、樹脂用量11 mL、pH 4.0、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL。在此條件下普洱茶多糖溶液的脫色率高達(dá)82.33%，蛋白質(zhì)去除率為70.89%。用纖維素DEAE-52陰離子樹脂分離經(jīng)D101樹脂脫色和蛋白質(zhì)去除的普洱茶多糖能得到6 個(gè)多糖級(jí)分。

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Purifi cation and Separation of Pu-Erh Tea Polysaccharide by Resin

YANG Xinhe1,2, HUANG Jian’an2, LIU Zhonghua1,2,*, MAO Qingli1,2
(1. School of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 2. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China)

Among ten types of macroporous resins, D101 resin was selected as the best for the decolorization and deproteinization of Pu-Erh tea polysaccharides. When 50 mL of the sample at a concentration of 3.8 mg/mL, pH 4 was adsorbed by 11 mL of D101 resin 50 ℃, the decolorization rate was 82.33% and the removal rate of protein was 70.89%. Six polysaccharide fractions were obtained after subsequent DEAE-52 cellulose column chromatography.

resin; Pu-Erh tea; polysaccharide; purifi cation; separation

S571.1

A

1002-6630（2015）02-0019-06

10.7506/spkx1002-6630-201502004

2014-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370692；31370691）；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014CFB573）

楊新河（1974—），男，副教授，博士，主要從事茶及功能食品研究。E-mail：hbxhyang@163.com

*通信作者：劉仲華（1965—），男，教授，博士，主要從事茶及功能食品研究。E-mail：lark-liu@163.com