脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

劉俊杰 劉茜 陳曉寧 姜俊慧

（山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺(tái) 264003）

脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

劉俊杰 劉茜 陳曉寧 姜俊慧

（山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺(tái) 264003）

脂肪酶主要應(yīng)用于食品工業(yè)，本研究從10份土壤樣品中通過(guò)富集培養(yǎng)分離出6株產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵，平板劃線(xiàn)；然后對(duì)脂肪酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，以葡萄糖1.5%、硫酸銨0.7%、磷酸氫二鉀0.1%、牛肉膏1.25%、硫酸鎂0.211%、橄欖油乳化液1.41%為發(fā)酵培養(yǎng)基，在250r/min、30℃下培養(yǎng)72h。此時(shí)可獲得高產(chǎn)的脂肪酶菌株。酶活力的最適條件：溫度50℃，pH 8.5，水浴30min。此時(shí)測(cè)定的酶活力最大。最后，對(duì)分離菌株進(jìn)行常規(guī)方法的細(xì)菌鑒定。

微生物；脂肪酶；篩選

脂肪酶是一類(lèi)非常重要的水解酶，是目前應(yīng)用最為廣泛的工業(yè)用酶之一，脂肪酶目前主要應(yīng)用于食品工業(yè)。利用脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)各種香精酯，作調(diào)料劑；使用具有1,3－專(zhuān)一性的微生物脂肪酶提高食用油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和增加食用油的花色品種，制備代可可酯等高檔油脂；另外，脂肪酶還可以用于酒類(lèi)的去濁除渣、改善面包質(zhì)量，改善蛋白的發(fā)泡等等方面。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，來(lái)源廣泛。在各種來(lái)源的脂肪酶中，以細(xì)菌脂肪酶在有機(jī)相催化的反應(yīng)類(lèi)型最多、反應(yīng)活性及穩(wěn)定性最高，其中假單孢菌屬菌株所產(chǎn)脂肪酶尤為顯著。脂肪酶（Lipase EC3.1.1.3）又稱(chēng)三?；视王；饷福且环N特殊的酯鍵水解酶，它不需要輔酶即可催化油水界面的甘油三酯水解生成甘油及長(zhǎng)鏈脂肪酸。脂肪酶的水解底物一般為天然油脂，水解部位是底物甘油三酯中1（或3）位和2位的酯鍵，反應(yīng)產(chǎn)物為甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸。從催化特性來(lái)看，脂肪酶可以催化酯類(lèi)化合物的分解、合成以及酯交換，具有化學(xué)選擇性和高度的立體異構(gòu)專(zhuān)一性，且此反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶反應(yīng)的重要特征是異相系統(tǒng)反應(yīng)（即在油—水的界面上作用）或有機(jī)相中的作用。這不僅發(fā)展了“界面酶學(xué)”，也促進(jìn)了“非水酶學(xué)”的研究[1-5]。脂肪酶主要采用從生物體中提取的方法來(lái)獲得，但由于動(dòng)植物含酶量少、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)條件復(fù)雜，因此在制取酶時(shí)常以微生物作為原料，并且微生物資源豐富，生產(chǎn)不受自然環(huán)境的影響，可用人工控制來(lái)大量生產(chǎn)目的酶。此種方法產(chǎn)酶周期短，生產(chǎn)成本低，是一種經(jīng)濟(jì)而實(shí)用的方法。

脂肪酶作為新的生物催化劑有著得天獨(dú)厚的優(yōu)越性，其在此方面的應(yīng)用需進(jìn)行更深入的研究。利用脂肪酶催化技術(shù)轉(zhuǎn)化廢棄油脂為生物柴油，不僅拓寬了脂肪酶的應(yīng)用范圍，提供了可替代能源，而且可變廢為寶，減少環(huán)境污染。本課題的目的是篩選具有脂肪酶高產(chǎn)活性的菌株，為下一步研究其催化活性作準(zhǔn)備。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

聚乙烯醇（PVA），上海石化水處理廠(chǎng)。橄欖油，化學(xué)純，上海化學(xué)試劑供應(yīng)站。蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、黃豆粉、葡萄糖，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂、氯化鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。硫酸銨，化學(xué)純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。碳酸鈉，化學(xué)純，天津博迪化工股份有限公司。維多利亞藍(lán)B，化學(xué)純，天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-TP11-5架盤(pán)藥物天平，上海精科天平儀器廠(chǎng)；

ALC110.4電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；

SW-CJ-1G型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

SK-1快速混勻器，金壇市富華儀器有限公司；

SHP-2500型低溫生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

HZQ-Q全溫振蕩器，東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；

顯微鏡，奧林巴斯；

高溫滅菌鍋。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

2.1.1 富集培養(yǎng)基的配置

富集培養(yǎng)基的組成包括橄欖油2.0%、硫酸銨0.5%、蛋白胨1.0%、磷酸氫二鉀0.5%、七水硫酸鎂0.1%，用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至9.5～10.0。

2.1.2 肉汁胨培養(yǎng)基的配置

肉汁胨培養(yǎng)基的組成成分主要包括牛肉膏為0.3%，蛋白胨為1.0%，氯化鈉為0.5%，瓊脂為1.5%～2.0%，pH為7.0～7.2。

2.1.3 平板分離培養(yǎng)基的配置

在肉汁胨培養(yǎng)基中加入2.5%橄欖油和1.5%瓊脂，用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至9.5～10.0，滅菌后冷卻到60℃，加入維多利亞藍(lán)B（4mg/100mL），保持無(wú)菌條件乳化1min倒平板。

2.1.4 初篩培養(yǎng)基的配置

橄欖油雙層瓊脂平板，底層含瓊脂1.5%、橄欖油0.5%，分裝試管（10mL/支），滅菌后乳化（快速混勻），倒平板；表層為肉汁胨培養(yǎng)基（含1.5%瓊脂），分裝試管（10mL/支）滅菌，待底層凝固后倒平板。

2.1.5 復(fù)篩培養(yǎng)基的配置

復(fù)篩培養(yǎng)基的組成包括黃豆粉2.0%、玉米漿2.0%、可溶性淀粉1.0%、磷酸氫二鉀0.5%、硝酸鈉0.5%，pH為9.0，300mL三角瓶裝液30mL，0.1MPa滅菌20min。

2.1.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置組成

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括葡萄糖1.5%、硫酸銨0.7%、磷酸氫二鉀0.1%、牛肉膏1.25%、硫酸鎂0.211%、橄欖油乳化液1.41%，300mL三角瓶裝液，121℃滅菌20min。

2.2 土樣的采集

從濟(jì)南、威海、青島、濰坊、煙臺(tái)等地采集了啤酒廠(chǎng)、面粉廠(chǎng)、菜市場(chǎng)、污水場(chǎng)附近土樣10份。

2.3 土樣的處理

稱(chēng)取1g土樣，加入盛有10mL無(wú)菌水的試管中，充分震蕩，靜置。

2.4 菌種的篩選

2.4.1 富集培養(yǎng)

取處理后的土樣上清液5mL加入盛有25mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、150r/min搖瓶培養(yǎng)。3～5d后，移取5mL培養(yǎng)液至另一盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)同樣操作2～3次，平板分離[6]。

2.4.2 平板分離

用接種環(huán)沾取一定量的經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)的菌液，在平板上劃線(xiàn)，30℃培養(yǎng)2～3d。

2.4.3 斜面保藏

將平板中有藍(lán)綠色變色圈的菌落挑至肉汁胨培養(yǎng)基上保藏，供初篩用。

2.4.4 初篩

將平板分離到的菌株從新鮮斜面上用無(wú)菌水洗下，經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布初篩培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3d。將初篩中透明圈較大的菌落挑至肉汁胨斜面培養(yǎng)基上保藏，供復(fù)篩用。

2.4.5 復(fù)篩培養(yǎng)

挑取一環(huán)新鮮肉汁胨斜面種子，接入肉汁胨液體種子培養(yǎng)基中，30℃、150r/min培養(yǎng)24h。然后取1mL液體種子于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下，搖瓶發(fā)酵72h。發(fā)酵液離心（3000r/min，20min），取上清液測(cè)酶活。

2.4.6 發(fā)酵培養(yǎng)

取酶活性高的菌株發(fā)酵液5mL，接入到發(fā)酵培養(yǎng)集中，30℃、220r/min下72h。然后取發(fā)酵液于3000r/min條件下離心20min，取上清液測(cè)酶活。

2.5 脂肪酶活性的檢測(cè)

2.5.1 酶活的定義

在40℃、pH9.0的條件下，水解橄欖油每分鐘產(chǎn)生1μmol游離脂肪酸所需的酶量單位（U）[7]。

2.5.2 固體瓊脂平板測(cè)定法

1）瓊脂平板的制備

分別將2.5g瓊脂粉、6.25mL橄欖油、0.2g/L聚乙烯醇18.75mL、0.1g/L維多利亞藍(lán)B 2.5mL，加入500mL三角瓶中，加熱溶解瓊脂粉，趁熱用高速組織搗碎機(jī)均質(zhì)，倒平皿，靜置冷卻，制成含酶作用底物和指示劑的固體瓊脂平板。

2）應(yīng)用平板法測(cè)定酶活性

在已制成的固體瓊脂平板上用打孔器打孔（直徑3.5mm），打孔后用注射針頭將孔內(nèi)瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂與平皿底部貼緊，將30μL待測(cè)酶液加入孔中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)一段時(shí)間，定時(shí)觀(guān)察孔周?chē)淖兩闆r。變色圈越大說(shuō)明產(chǎn)酶的能力越強(qiáng)，反之則越弱。

3）堿性脂肪酶活力測(cè)定

橄欖油與2%聚乙烯醇溶液以1:5體積比進(jìn)行混合，高速勻漿，成為乳白色均勻穩(wěn)定的乳化液。以橄欖油乳化液為底物，在pH 9.5、40℃下，反應(yīng)30min，用滴定法測(cè)定產(chǎn)生的脂肪酸，以分解底物（橄欖油）釋放出1mmol/min游離脂肪酸所需酶量定義為1個(gè)堿性脂肪酶活力國(guó)際單位（IU），以IU/mL表示[8]。

2.6 菌種的保藏

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩到合適的菌株后，需要將菌株進(jìn)行保藏。

2.6.1 凍存液的配置

配置凍存液10mL，凍存液的組成包括甘油1g、氯化鈉0.09g、純化水9.2mL。

2.6.2 方法

10mL凍存液分裝到10個(gè)無(wú)菌的1.5mL離心管，在無(wú)菌條件下，從相應(yīng)斜面上挑取一大環(huán)菌體（因?yàn)樵趦龃孢^(guò)程中會(huì)有部分菌體死亡）接入離心管中，做好標(biāo)記，然后放入冰箱中凍存。

2.7 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

2.7.1 酶最適作用溫度

在不同溫度下（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）進(jìn)行酶活測(cè)定，得到相同的酶液在不同的反應(yīng)溫度下所具有的酶活力單位[9]。

2.7.2 酶最適作用pH

配制11種從pH 5～10，間隔為0.5pH單位的緩沖液，利用平板測(cè)定法測(cè)出酶反應(yīng)的最適pH。

2.7.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

將酶在不同的靜置時(shí)間（5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min）取樣測(cè)定酶反應(yīng)液中酶的活力，作圖。

2.7.4 穩(wěn)定時(shí)間對(duì)酶活的影響

根據(jù)反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短在5～40min間隔相同時(shí)間取樣，測(cè)定反應(yīng)結(jié)束后酶活性的變化情況并作圖。

2.8 高活性菌株的分離鑒定

根據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及主要生理生化特征對(duì)篩選出的高活力的菌株進(jìn)行鑒定。菌種生理生化鑒定主要參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]。

通過(guò)對(duì)所篩選出的菌株進(jìn)行普通的細(xì)菌染色，觀(guān)察其形態(tài)特征。進(jìn)行革蘭氏染色進(jìn)一步確定該菌株的各種主要特性。通過(guò)整個(gè)篩選過(guò)程了解菌株的培養(yǎng)特性了解該菌株生長(zhǎng)所需的最佳溫度、pH、產(chǎn)酶活性最高的反應(yīng)時(shí)間及靜置時(shí)間。采用生理生化及16sRNA方法鑒定最終確定我們所篩選出的菌株的類(lèi)型。

3 結(jié)果與分析

3.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

從10份土樣中，經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、平板劃線(xiàn)、初篩、斜面接種、復(fù)篩共獲得6株產(chǎn)脂肪酶的菌株。根據(jù)菌株產(chǎn)生脂肪酶后再加入維多利亞藍(lán)B的培養(yǎng)基中可產(chǎn)生藍(lán)綠色變色圈這一特征，挑選出產(chǎn)脂肪酶的菌株，并與不產(chǎn)脂肪酶的菌株進(jìn)行對(duì)照（圖1）。

圖1 菌種篩選結(jié)果Fig.1Strain screening results

3.2 酶活測(cè)定

3.2.1 固體瓊脂平板法

圖2 固體瓊脂平板法測(cè)定結(jié)果Fig.2Test result with solid agar plate method

圖2顯示的是固體瓊脂平板法測(cè)定結(jié)果。圖中，平板上的1、2、3、4、5、6個(gè)透明圈分別代表所篩選出的六株不同的產(chǎn)脂肪酶的菌株菌懸液所產(chǎn)生的透明圈。平板中加入維多利亞藍(lán)B作為指示劑，遇酸變藍(lán)。其作用機(jī)理為：脂肪酶產(chǎn)生菌可產(chǎn)生脂肪酶，脂肪酶可以分解加入培養(yǎng)集中的橄欖油，使其轉(zhuǎn)變成酸，維多利亞藍(lán)B遇酸變藍(lán)。所以可以根據(jù)所產(chǎn)生的變色圈的大小來(lái)判斷其產(chǎn)脂肪酶的能力。圖中變色圈的大小表示不同菌株產(chǎn)脂肪酶的能力，變色圈越大說(shuō)明其產(chǎn)脂肪酶的能力越強(qiáng)。2號(hào)變色圈最大說(shuō)明其產(chǎn)脂肪酶的能力最強(qiáng)。

3.2.2 滴定法

由于透明圈法只能定性測(cè)定脂肪酶酶活，不能定量，因此采用滴定法進(jìn)行定量。利用脂肪酶可以分解脂肪產(chǎn)生酸，用0.05mol/L的氫氧化鈉滴定，同時(shí)用酚酞作為指示劑。當(dāng)指示劑由無(wú)色變成粉紅說(shuō)明到達(dá)到滴定終點(diǎn)。對(duì)篩選出來(lái)的6株具有較大透明圈的菌株在不同溫度（20、30、40、50、60℃）、不同pH（7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)作平行實(shí)驗(yàn)。共測(cè)定5次。酶活最高的一株到達(dá)7.2U。然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在同樣的情況下測(cè)定3次酶活，最高的一株活性達(dá)到12U。酶活的計(jì)算如下列公式如下。

式中：V—樣品所消耗堿的體積，mL；

V0—空白對(duì)照所消耗堿的體積，mL；

t—反應(yīng)時(shí)間，min；

50—1 mL0.05mol/L氫氧化鈉的微摩爾數(shù)；

n—稀釋倍數(shù)。

3.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

3.3.1 酶最適作用溫度

酶都有其最適的反應(yīng)溫度，因而在不同溫度下酶所表現(xiàn)的活性也不同。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響表現(xiàn)為兩個(gè)方面：一是，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度加快，酶活力高。二是，由于酶是生物催化劑，是一類(lèi)特殊的蛋白質(zhì)，超過(guò)一定的溫度，酶會(huì)發(fā)生變性而失活。實(shí)驗(yàn)中酶液濃度相同，pH為8，溫度選擇20、30、40、50、60℃，研究溫度對(duì)酶活的影響，反應(yīng)30min，測(cè)量其在不同反應(yīng)溫度下對(duì)相同底物的作用酶活。實(shí)驗(yàn)中用的酶是上面實(shí)驗(yàn)分離得到酶活最高（12U）的脂肪酶（下同），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3（見(jiàn)下頁(yè)）。

圖3 酶反應(yīng)的最適溫度Fig.3The optimum temperature of the enzyme reaction

由圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)溫度升高反應(yīng)速度加快，酶活力升高，當(dāng)溫度升高到50℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，超過(guò)這個(gè)溫度后，酶活力開(kāi)始下降。因此，50℃為脂肪酶的最適溫度。

3.3.2 酶最適作用pH

環(huán)境pH影響酶蛋白的構(gòu)象和酶分子的解離狀態(tài)，因此不同的酶具有各自的最適pH值。為了測(cè)定不同pH條件對(duì)酶活性的影響，選用堿性脂肪酶，在30℃及相同底物下，pH為7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，反應(yīng)30min，測(cè)定脂肪酶的酶活。利用平板測(cè)定法測(cè)出酶反應(yīng)的最適pH。其原理是觀(guān)察其產(chǎn)生變色圈直徑的大小來(lái)粗測(cè)酶活性的大小。變色圈直徑越大說(shuō)明酶活性越大，反之則越小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶反應(yīng)的最適pHFig.4The optimum pH of the enzyme reaction

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，pH升高，反應(yīng)速度加快，酶活力升高，當(dāng)pH升高到8.5時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，超過(guò)這個(gè)pH后酶活力開(kāi)始下降。

3.3.3 酶的最適反應(yīng)時(shí)間

酶反應(yīng)過(guò)程中達(dá)到最高活力需要一段時(shí)間。不同酶在相同的底物濃度、溫度、pH的條件下，測(cè)量不同反應(yīng)時(shí)間（5、10、15、20、25、30、35min），酶活的大小，研究該脂肪酶達(dá)到最高點(diǎn)所需的時(shí)間。這對(duì)酶在生產(chǎn)應(yīng)用中時(shí)間的控制有一定的影響。在不同反應(yīng)時(shí)間下對(duì)所篩出的脂肪酶進(jìn)行了比較。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.5The influence of reaction time for Lipase activity

由圖5可以看出，在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15min時(shí)酶活力達(dá)到最大值，隨后酶活力開(kāi)始下降。

3.3.4 穩(wěn)定時(shí)間對(duì)酶活的影響

反應(yīng)終止后體系并沒(méi)有穩(wěn)定，反應(yīng)尚未結(jié)束，需要一段時(shí)間才能達(dá)到平衡。酶在30℃、pH8.5的條件下反應(yīng)30min后終止，然后間隔不同的靜置時(shí)間后測(cè)定酶反應(yīng)液的酶活。

圖6 穩(wěn)定時(shí)間對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.6The influence of standing time for Lipase activity

由圖6可知，在一定穩(wěn)定時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的推移，酶活力升高，當(dāng)穩(wěn)定時(shí)間達(dá)到10min時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，超過(guò)這個(gè)穩(wěn)定時(shí)間后酶活力開(kāi)始下降。

3.4 菌種鑒定

通過(guò)對(duì)所篩出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和普通的細(xì)菌染色法最終確定該菌菌種，其顯微鏡照片顯示為革蘭氏陰性短桿菌，如圖7（見(jiàn)下頁(yè)）所示。

4 討論

本文通過(guò)篩選到了預(yù)期的產(chǎn)脂肪酶的菌株，而且產(chǎn)量較高。特別是通過(guò)對(duì)篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，其產(chǎn)酶活性有了很大的提高，酶活達(dá)到12U。進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)將在后續(xù)的工作中進(jìn)行。

對(duì)脂肪酶酶活的測(cè)定是一個(gè)比較困難的問(wèn)題，測(cè)定結(jié)果與底物的種類(lèi)、底物的形態(tài)、體系的pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間都有關(guān)系。除了上述影響條件以外，還有PVA的聚合度、乳化液制備的攪拌速度及終止劑等因素。需要以后進(jìn)一步研究。

本文只對(duì)菌株進(jìn)行了形態(tài)觀(guān)察，采用生理生化及16sRNA方法鑒定正在進(jìn)行中，有望篩選到一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的脂肪酶產(chǎn)生菌。

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Screening of Lipase Producing Strain

LIU Jun-jie LIU Qian CHEN Xiao-ning JIANG Jun-hui
(Shandong Lvye Pharmaceutical Co.,Ltd.,Yantai 264003,China)

The main research aspects and results are as following:First,6 strains producing lipase were isolated from 10 soil samples by enrichment culture,plate streaking and fermentation.Second,the properties of lipase were studied,after fermentation under the medium including 1.5%glucose,0.7%(NH4)2SO4,0.1%K2HPO4,1.25%beef cream,0.211% MgSO4·7H2O,1.41%olive oil and the conditions 250r/min,30℃and 72h.The optimum reaction temperature,pH,reaction time were 50℃,8.5 and 30min respectively.Finally,the isolated strain was conserved and identified by using conventional methods for bacteria identification.

Microorganism;lipase;screening

X172

A

1008-1038(2015)04-0033-06

2014-10-25

劉俊杰（1984—），男，助理工程師，研究方向?yàn)榫N篩選