H7N9禽流感病毒基因檢測技術(shù)研究進(jìn)展

張 賽(綜述)，陸 軍(審校)

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，安徽 滁州 239000)

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檢測醫(yī)學(xué)

H7N9禽流感病毒基因檢測技術(shù)研究進(jìn)展

張 賽1,2△(綜述)，陸 軍1※(審校)

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，安徽 滁州 239000)

2013年3月在上海和安徽兩省市率先發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病例，現(xiàn)已累計(jì)報(bào)告數(shù)百例病例。H7N9禽流感病毒因其對人類的高致病性和迅速的傳播速度引起全球的廣泛關(guān)注?？焖?、準(zhǔn)確的檢測對H7N9禽流感的疫情監(jiān)測和控制極為重要。該文就目前應(yīng)用于H7N9禽流感病毒研究中的基因檢測技術(shù)(包括聚合酶鏈反應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基因芯片、液相芯片、依賴核酸序列擴(kuò)增法、高通量測序等)的研究進(jìn)展予以綜述。

禽流感病毒;H7N9；基因檢測技術(shù)

2013年3月底，上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病例，引發(fā)此次疫情的是一種新型重配病毒[1-3]。人感染H7N9禽流感病毒臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽和少痰等流感樣癥狀[4]。目前，尚不能排除人傳人的可能[5]。H7N9禽流感病毒檢測是人感染H7N9禽流感防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其病原學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室要求高，條件苛刻，不易普遍實(shí)施?；驒z測技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、簡潔、快速等優(yōu)點(diǎn)，克服了病原學(xué)檢測的局限性，為H7N9禽流感病毒檢測提供了新途徑。因此，基因檢測技術(shù)在H7N9禽流感病毒防治中將會有更重要的應(yīng)用前景?，F(xiàn)主要對國內(nèi)外檢測H7N9禽流感病毒的基因檢測技術(shù)進(jìn)行綜述。

1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是利用體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量目的基因。PCR是近年來學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于H7N9禽流感病毒檢測，具有快捷、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)。

1.1 實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR) 近年來，以基因檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的禽流感病毒檢測方法飛速發(fā)展，實(shí)時(shí)RT-PCR是RNA病毒基因檢測中使用最普遍的分子擴(kuò)增法，通過擴(kuò)增標(biāo)本中病毒基因組RNA片段，可鑒定流感病毒并進(jìn)一步亞型分析[6]，被認(rèn)為是H7N9禽流感檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[5,7]。Gao等[1]利用RT-PCR在3例患者的咽拭子中提取到H7N9禽流感病毒核酸。該方法使用廣泛，但反轉(zhuǎn)錄的DNA分子易污染實(shí)驗(yàn)儀器和環(huán)境，試驗(yàn)結(jié)果會出現(xiàn)假陽性和假陰性。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)在1996年由美國Applied Biosystems公司推出[8]，是在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過循環(huán)閾值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Wong等[9]設(shè)計(jì)的“一步法”實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 對H7N9禽流感病毒檢測，靈敏度達(dá)到0.04 TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染性量)，整個(gè)檢測過程只需要3 h。Zhu等[10]針對1例安徽株和2例上海株H7N9禽流感病毒的HA、NA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和賽博綠熒光標(biāo)記探針，通過測試106拷貝/μL～10拷貝/μL系列10倍稀釋的體外轉(zhuǎn)錄病毒，以循環(huán)閾值對應(yīng)的RNA拷貝數(shù)構(gòu)造標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立以賽博綠為探針的RT-PCR檢測方法；結(jié)果顯示，該試驗(yàn)建立的H7、N9標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與對應(yīng)的RNA拷貝數(shù)具有很好的線性關(guān)系，H7相關(guān)系數(shù)為0.991，N9相關(guān)系數(shù)為0.997，最低檢測限為10拷貝，與Taqman探針靈敏度類似。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速并且可以對樣品進(jìn)行定量分析的優(yōu)點(diǎn)，已大規(guī)模使用于流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 多重RT-PCR 多重RT-PCR法是在同一PCR反應(yīng)體系中加入2個(gè)以上病毒亞型或多種病毒的特異性引物，利用目的片段的長度不同，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)病毒亞型或多種病毒在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測，是一種快速、敏感且經(jīng)濟(jì)有效的檢測方法。羅思思等[11]針對H7N9禽流感病毒的HA、NA基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針建立雙重RT-PCR；結(jié)果顯示，該方法具有快速、特異和敏感的優(yōu)點(diǎn)，檢測下限為102 拷貝/L；實(shí)現(xiàn)了對H7N9禽流感病毒檢測的“一步法”，引物的特異性和探針的特異性保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)比普通PCR檢測技術(shù)靈敏度高100倍以上。莫秋華等[12]針對H7N9禽流感病毒的HA和NA基因設(shè)計(jì)特異性引物，選擇人源基因beta-actin設(shè)計(jì)質(zhì)控引物，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件建立“一步法”四重RT-PCR 反應(yīng)體系，對混合樣進(jìn)行提取，沒有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，反應(yīng)體系特異性強(qiáng)，對不同亞型病毒的檢測無交叉反應(yīng)，引物之間無相互干擾，對30份核酸樣品經(jīng)盲法試驗(yàn)評價(jià)與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是Notomi等[13]在2000年建立的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過對靶基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)2對外引物和2對內(nèi)引物，在恒溫(60～65 ℃)條件下，通過鏈置換嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的作用反應(yīng)l h，實(shí)現(xiàn)目的靶序列從很低拷貝數(shù)擴(kuò)增到109拷貝數(shù)。董志珍等[14]利用LAMP檢測H7N9禽流感病毒(安徽株)，其靈敏度達(dá)到10拷貝，靈敏度與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR一致，該方法具有操作簡單、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)果根據(jù)擴(kuò)增副產(chǎn)物形成的沉淀肉眼直接判斷。因其不依賴專門的儀器設(shè)備可在基層或小型實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場檢測、臨床快速診斷，是一種新型的H7N9禽流感病毒快速檢測的技術(shù)與方法。Ge等[15]利用RT-LAMP對80份H7N9禽流感臨床樣本的HA基因和NA基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均為100%。Zhang等[16]利用RT-LAMP對135例臨床樣本檢測，試驗(yàn)可在12～23 min完成；H7亞型基因的檢出限度為10拷貝,而其對應(yīng)的N9基因檢測限度為5拷貝,靈敏度是實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的100倍。

3 基因芯片

基因芯片的基本原理是將RT-PCR獲得的病毒基因的互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)或合成的特異性寡核苷酸探針固化于芯片上，然后用不同熒光標(biāo)記序列或樣品(DNA或cDNA)與芯片上Cy3、Cy5標(biāo)記的核酸探針標(biāo)記的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，通過對雜交信號的檢測進(jìn)而獲取細(xì)胞或組織的大量基因信息[17]。王慧煜等[18]對29份H7亞型陽性標(biāo)本進(jìn)行正向雜交基因芯片檢測,結(jié)果與病毒分離的結(jié)果符合率達(dá)100%。王秀榮等[19]依據(jù)M蛋白進(jìn)行基因型鑒定和HA基因亞型鑒定，用Cy5熒光標(biāo)記在基因芯片平臺上構(gòu)建檢測H7亞型禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)技術(shù)模型，檢測H7亞型的cDNA,雜交達(dá)到預(yù)期結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)具有特異性好、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但因其檢測成本高、硬件要求高等缺點(diǎn)，在流感病毒檢測中的應(yīng)用還遠(yuǎn)低于其他檢測方法。

4 液相芯片

液相芯片，也稱為懸浮陣列、流式熒光技術(shù)，是基于美國Luminex公司研制的多功能流式點(diǎn)陣儀開發(fā)的多功能生物芯片平臺[20]。它是通過紅、綠兩束激光分別檢測可進(jìn)行100種不同生物學(xué)反應(yīng)的微球探針上的編碼和報(bào)告熒光來實(shí)現(xiàn)定性和定量的目的，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺，是將數(shù)字信號處理技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)及傳化學(xué)技術(shù)融為一體的新型生物分子檢測技術(shù)。張曉娜等[21]針對H7亞型禽流感保守基因，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，將多重不對稱RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與偶聯(lián)熒光微球的探針進(jìn)行雜交,建立多重液相芯片檢測方法，對50份已知病毒的樣品進(jìn)行液相芯片方法和禽流感檢測試劑盒雙盲試驗(yàn)，兩者符合率為100%，H7亞型禽流感核酸的最低檢出量為28.7 pg/μL，檢測的特異性良好，且禽流感常見病毒與其他亞型無交叉反應(yīng)，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在10%以內(nèi)。

5 依賴核酸序列的擴(kuò)增法

依賴核酸序列的擴(kuò)增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一項(xiàng)以RNA為模板無需反轉(zhuǎn)錄的快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，賴于鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作而完成。Collins等[22]基于M基因和H7亞型的HA基因已成功開發(fā)出可檢測禽流感群特異性H7亞型(NASBA-H7)的NASBA/ECL(電化學(xué)發(fā)光)檢測試劑盒，檢出時(shí)間只需6 h，比商品化的免疫檢測試劑盒敏感至少高1000倍，比常規(guī)PCR方法也敏感許多，與現(xiàn)行病毒培養(yǎng)的檢測方法靈敏度相當(dāng),可準(zhǔn)確無誤地檢測出病毒。該方法的優(yōu)點(diǎn)是RNA分子不易對實(shí)驗(yàn)儀器和環(huán)境造成污染，避免了試驗(yàn)結(jié)果的假陽性，缺點(diǎn)是檢測成本過高。

6 高通量測序

高通量測序又名下一代測序，是將目標(biāo)DNA剪切為小片段結(jié)合到固相表面進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，每次只復(fù)制1個(gè)堿基(A、C、T、G)，通過高分辨率的成像系統(tǒng)檢測信號。趙康辰等[23]以U12引物反轉(zhuǎn)錄cDNA,通用流感病毒全基因擴(kuò)增引物混合物生成雙鏈cDNA制備高通量測序模板對8份樣品進(jìn)行檢測，從模板制備、文庫構(gòu)建到序列及數(shù)據(jù)分析等在2 d內(nèi)完成；該方法不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，病毒RNA可直接制備測序模板，測序模板用量只需要1 ng的雙鏈cDNA，具有準(zhǔn)確性高、周期短、可同時(shí)對多個(gè)樣本進(jìn)行檢測且成本相對較低等優(yōu)點(diǎn)，使大規(guī)模H7N9禽流感病毒基因組檢測變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

7 小 結(jié)

H7N9禽流感疫情爆發(fā)讓公眾的眼光再次聚焦于流感實(shí)驗(yàn)室診斷?；驒z測技術(shù)為H7N9禽流感提供了高靈敏度、強(qiáng)特異性且快速的診斷，為疫情的控制提供了寶貴的時(shí)間和準(zhǔn)確的流行病學(xué)信息，避免了疫情的大規(guī)模蔓延。但基因檢測技術(shù)并不能解決所有問題，有一定的局限性。因此，在H7N9禽流感病毒的檢測過程中，要不斷探索不同檢測技術(shù)及不同學(xué)科之間的融合，取長補(bǔ)短，推進(jìn)H7N9禽流感病毒基因檢測技術(shù)進(jìn)入新的發(fā)展階段。

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Advance in Gene Techniques for Detection of Avian Influenza A (H7N9) Virus

ZHANGSai1,2,LUJUN1.

(1.DepartmentofAetiology&Immunology,MedicalCollege,AnhuiUniversityofScience&Technology，Huainan232001,China; 2.DepartmentofCentralLaboratory,ChuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuzhou239000,China)

In March 2013,cases of avian influenza A(H7N9) infection have been firstly found in Shanghai and Anhui,and there has been hundreds of cases reported so far.The influenza A(H7N9) is a pathogen with highly pathogenicity to human and able to spread rapidly,which has attracted global attention.It is very important to establish a rapid and sensitive method for avian influenza A(H7N9) detection and control.Here is to make a review of the gene techniques used in detection of avian influenza A,including polymerase chain reaction,loop-mediated isothermal amplification,gene chip,liquid chip,nucleic acid sequence-based amplification and high-throughput sequencing.

Bird flu virus; H7N9; Gene detection techniques

R373.13；R511.7

A

1006-2084(2015)12-2226-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.042

2014-10-10

2014-12-18 編輯：鄭雪