綜述表面增強(qiáng)拉曼散射光譜體內(nèi)藥物分析技術(shù)

石玉也+鹿愛娟+黃小燕+陳傳品+劉文芳

摘要：表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）作為一種新興的藥物分析手段，具有樣本處理簡單、非侵入性檢測、靈敏度高、提供豐富指紋圖譜信息等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)高靈敏度無損檢測的同時(shí)可獲得目標(biāo)檢測物的分子結(jié)構(gòu)信息。本文綜合論述了體內(nèi)藥物分析的常用方法以及SERS在該方面的發(fā)展現(xiàn)狀，并詳細(xì)介紹了SERS基底的分類和制備方法以及SERS在藥物分析尤其是體內(nèi)藥物分析方面的應(yīng)用。針對體內(nèi)藥物分析，主要介紹不分離樣本情況下，SERS用于唾液、尿液、血液等生物樣本中目標(biāo)檢測物的直接分析技術(shù)。

關(guān)鍵詞：體內(nèi)藥物分析；生物樣本；表面增強(qiáng)拉曼光譜

中圖分類號：G642 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）15-0053-03

一、前言

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）是一種利用表面電磁場增強(qiáng)提高拉曼信號的分析技術(shù)。與紅外（IR），紫外（UV），核磁共振（NMR），熒光，X-衍射等光學(xué)分析手段相比，具有很多突出優(yōu)勢。表面增強(qiáng)拉曼檢測限非常低，可用于痕量分析，甚至可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測物的單分子檢測；分析過程只需要數(shù)毫秒到數(shù)十秒不等，可實(shí)現(xiàn)對被分析物快速檢測和實(shí)時(shí)信息反饋；能夠提供豐富的指紋圖譜信息而具有較高的分析準(zhǔn)確性；水分子的拉曼響應(yīng)較弱，因此適用于含水樣本的分析，尤其是生物樣本，無需復(fù)雜的前處理即可檢測；與其他分析方法如IR，核磁共振等相比，對樣本純度要求低，可大大減少樣本前處理工作并節(jié)約分析成本；拉曼檢測所需樣本量極少，且為非入侵破壞性檢測，可為目標(biāo)檢測物的后續(xù)分析提供方便。因其可以從復(fù)雜基質(zhì)中提取目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)信息，故表面增強(qiáng)拉曼光譜尤其適用于生命科學(xué)方面的分析應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析是指利用儀器對人或動物體內(nèi)的血液、尿液、體液、排泄物、組織、器官等樣本中藥物及其代謝物的分布進(jìn)行分析，了解藥物進(jìn)入體內(nèi)后代謝的途徑以及代謝方式等信息，從而指導(dǎo)藥品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析最大的挑戰(zhàn)是生物樣品成分復(fù)雜、藥物及其代謝物濃度低。一般而言，樣本中除了目標(biāo)檢測物外，還含有大量的蛋白質(zhì)、多種內(nèi)源性物質(zhì)等，而藥物本身的代謝產(chǎn)物、其他共存的藥物等也會對檢測形成一定的影響。因此其對分析儀器的分離效率和檢測限有較高要求。表面增強(qiáng)拉曼光譜由于其超高的靈敏度和指紋圖譜分析等優(yōu)勢，在體內(nèi)藥物分析方面展現(xiàn)了良好的前景。

二、體內(nèi)藥物分析常用方法

目前常用的幾類生物樣品分析方法有：①色譜法，可用于大多數(shù)藥物的檢測。②免疫學(xué)方法，多用于蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)檢測。③微生物學(xué)方法，主要用于抗菌藥物的測定。

三、表面增強(qiáng)拉曼散射簡介

與紅外光譜相似，拉曼光譜是一種分子振動、轉(zhuǎn)動光譜。但前者是通過檢測分子偶極矩的變化，而后者則通過分子極化率的改變獲得相關(guān)信息。普通拉曼光譜的信號響應(yīng)非常弱，其強(qiáng)度大約只有激發(fā)光的10-10倍。同時(shí)，普通拉曼光譜的熒光干擾非常強(qiáng)，即便是目標(biāo)物或者基質(zhì)中極弱的熒光響應(yīng)，也能覆蓋拉曼散射。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)leischmann等首次報(bào)道了在粗糙的銀電極表面吸附的單層吡啶的高質(zhì)量拉曼光譜。三年后，Van Duyne等證明吸附在粗糙銀表面的每個(gè)吡啶分子的拉曼信號強(qiáng)度在比其在溶液中增強(qiáng)了106倍。該現(xiàn)象被定義為表面增強(qiáng)效應(yīng)。SERS是指當(dāng)目標(biāo)檢測分子被吸附到某些粗糙的金屬表面（如金、銀、銅等）上時(shí)，它們的拉曼散射強(qiáng)度會增加104～106倍；諧振時(shí)，可以高達(dá)1014～1015倍，其中又以銀的增強(qiáng)效果最佳。目前認(rèn)為SERS增強(qiáng)主要基于電磁場增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)兩種機(jī)制，納米粒子的形貌尺寸以及與相鄰納米粒的距離均會影響粒子周圍的電磁場，進(jìn)而影響增強(qiáng)效果，并且被測分子只有位于金屬納米粒產(chǎn)生的電磁場中時(shí)才會產(chǎn)生增強(qiáng)的效果，電磁場越強(qiáng)，增強(qiáng)效果越好。目前SERS技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、材料學(xué)、電化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等各個(gè)方面。

四、表面增強(qiáng)拉曼散射用于藥物分析

SERS應(yīng)用于藥物分析是近幾年才發(fā)展起來的。拉曼光譜可以從以下幾個(gè)方面應(yīng)用于藥物分析：①藥物的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)鑒定：拉曼光譜已經(jīng)被用于多種藥物的結(jié)構(gòu)分析，包括苯乙胺類鎮(zhèn)靜催眠藥、手性的β受體阻斷劑，鎮(zhèn)靜催眠藥等。②對活性成分的定量分析：目前已有通過偏最小二乘法和線性回歸分析阿司匹林、對乙酰氨基酚的拉曼數(shù)據(jù)，進(jìn)行定量檢測的相關(guān)報(bào)道。在選定的拉曼光譜頻率區(qū)間內(nèi)，通過改變參數(shù)可以對藥物中的活性成分進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。通過對拉曼光譜的分析，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了抗生素中含有的對乙酰氨基酚單斜和正交晶系含量的準(zhǔn)確檢測。③藥物的晶型的分析：拉曼光譜也可以用于藥物的多晶型分析。鹽酸雷尼替丁片中包含有兩種晶型的藥物——Ⅰ型和Ⅱ型，這兩種晶型可以采用拉曼光譜進(jìn)行區(qū)別并確定含量。該研究認(rèn)為，拉曼光譜是一種可以用于定量分析晶型含量的有效方法，商業(yè)藥品中的多晶型雜質(zhì)應(yīng)低于2%。目前，SERS用于藥物分析的相關(guān)研究主要集中在藥物標(biāo)準(zhǔn)品等純度較高體系的分析。已有相關(guān)研究包括檢測苯丙胺、地西泮等精神類藥物，嗎啡、可待因等麻醉藥物，地蟲硫磷等農(nóng)藥，另外還有5-氟尿嘧啶，利福霉素，阿司匹林等。這些研究多以銀納米溶膠為增強(qiáng)基質(zhì)，檢測標(biāo)準(zhǔn)樣本中的藥物，其最低檢測濃度可以達(dá)到10-6 mol/L。采用SERS分析生物的樣本中的目標(biāo)檢測物也有一定測嘗試。

五、表面增強(qiáng)拉曼散射用于體內(nèi)藥物分析

直接檢測是表面增強(qiáng)拉曼散射最普遍的檢測方式，目標(biāo)分子吸附在金屬納米粒上，即可得到目標(biāo)分子的指紋圖譜。大分子和小分子物質(zhì)的痕量檢測都有大量的文獻(xiàn)報(bào)道。用于生物樣本中的直接檢驗(yàn)主要針對于單一目標(biāo)檢測，根據(jù)生物樣本的種類，可分為唾液樣本分析，尿液樣本分析和血液樣本分析。唾液分析相對血漿等常用生物樣本有其獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，樣本的獲得不會對受試者產(chǎn)生創(chuàng)傷，減少了試驗(yàn)的危險(xiǎn)性和不良事件的產(chǎn)生。其次唾液成分簡單，99.5%以上的成分都是水，因此對樣本的處理要求也相對簡單而可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。第三，在微克級別時(shí)，唾液中的藥物含量與血液中的濃度幾乎是一致的。采用硅醇還原銀或金離子獲得SERS活性的毛細(xì)管，唾液中5-氟尿嘧啶，毒品（苯丙胺、地西泮、美沙酮、可卡因）等的檢測均已實(shí)現(xiàn)，但技術(shù)尚不成熟，檢測限也較高。前者先加水對唾液進(jìn)行稀釋，在去除硫氰酸根離子等的干擾后，其5-氟尿嘧啶的檢測限可以達(dá)到50μg/mL。Frank Inscore等對唾液樣本進(jìn)行固相萃取后，將其注入含金或銀溶膠的毛細(xì)管，并采用便攜式拉曼光譜儀檢測，分別檢測出了樣本中含有的可卡因、苯丙胺、海洛因等藥物。其檢測限雖只有0.5μg/mL，但采用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行檢測，為樣本的現(xiàn)場鑒定和實(shí)時(shí)檢測提供了可能。endprint

尿液是一種常見的樣本，在美國，每年大約有3億的尿液相關(guān)分析。Charles J. Choi在常用的IV或尿液收集軟管中嵌入了緊密排列的納米汞和SERS傳感器，實(shí)現(xiàn)了人工尿液中異丙嗪和尿素的在線定量監(jiān)測。其濃度—信號強(qiáng)度曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999，其檢測限大約為3mg/mL。Gerd Trachta等采用HPLC-SERS聯(lián)用的方法檢測了尿液和血液中的雙氫可待因、多賽平、西酞普蘭，曲米帕明，卡馬西平，美沙酮等藥物含量。該方法用乙酸乙酯對樣本進(jìn)行萃取富集后，再采用HPLC進(jìn)行分離，根據(jù)保留時(shí)間取分離后的樣本至SERS增強(qiáng)基底上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)SERS分析。采用該方法，他們檢測了兩個(gè)過量使用精神藥物而致死患者的尿液和血液，獲得了相關(guān)藥物的SERS圖譜。血液是人體組織的重要組成部分，當(dāng)人體組織處于不同狀態(tài)或人生理狀況發(fā)生變化時(shí)，體內(nèi)代謝物質(zhì)在血液中將有所反映，通過分析人血液的拉曼光譜以實(shí)現(xiàn)人體疾病的檢測是國內(nèi)外學(xué)術(shù)界關(guān)注的研究課題，按照全血取樣后的處理方法，又包括血漿和血清兩種。表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)具有高檢測靈敏度、可提供指紋圖譜、樣品前處理簡便，同時(shí)血液中富含的各種生化物質(zhì)容易與金屬納米粒子相結(jié)合，因此，將SERS技術(shù)應(yīng)用于人體血液檢測具有特別的優(yōu)勢。同時(shí)血液樣本具有易于獲得，容量較大，相關(guān)報(bào)道較多而易于對比借鑒等優(yōu)點(diǎn)。其中，血液中抗癌藥物的SERS檢測具有重大意義。抗癌藥物副作用與用藥劑量有顯著關(guān)系，故通過個(gè)體化監(jiān)測血藥濃度來調(diào)整給藥劑量可顯著降低抗癌藥物的副作用，提高病人對藥物的耐受性。Yuen C等用SERS檢測血漿樣本中的紫杉醇。其以微波處理金薄膜-聚乙烯顆粒，獲得重現(xiàn)性較高，增強(qiáng)效果非常好的增強(qiáng)基底。其標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本基本不需要進(jìn)一步處理即可進(jìn)行檢測，且檢測限可以達(dá)到10-8mol/L。

六、總結(jié)

SERS由于其超高的靈敏度，在體內(nèi)藥物分析中的發(fā)展不容小覷，雖然目前技術(shù)尚不成熟，但其基礎(chǔ)研究與應(yīng)用越來越受到大家的重視。目前，SERS應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析面臨的主要問題是：生物樣本的背景干擾太強(qiáng)，影響檢測；檢測限太高，難以達(dá)到體內(nèi)藥物分析的要求；常規(guī)方法所得基質(zhì)重現(xiàn)性較差，難以應(yīng)用過于體內(nèi)藥物分析。這些問題都需要通過改進(jìn)增強(qiáng)基底加以改進(jìn)，尤其是好的增強(qiáng)基底不僅需要有足夠的增強(qiáng)效果，更需要能滿足體內(nèi)藥物分析的重現(xiàn)性。目前已經(jīng)有針尖增強(qiáng)拉曼光譜、各種有序的納米粒陣列、甚至復(fù)合增強(qiáng)基底，可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測且能保證一定的重現(xiàn)性。同時(shí)編碼納米粒以其能植入芯片、活細(xì)胞、組織和一些列微小器官進(jìn)行間接檢測，展現(xiàn)出廣大的應(yīng)用前景。但其應(yīng)用均停留在實(shí)驗(yàn)室制備階段，距離推廣使用還有一定的距離。而將SERS分析發(fā)展成為一種標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)藥物分析手段則還需要更多的深入研究。

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