免疫學(xué)方法在混合精斑檢驗(yàn)中的應(yīng)用

張金輝(綜述),封　宇(審校)

(重慶警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，重慶 401331)

免疫學(xué)方法在混合精斑檢驗(yàn)中的應(yīng)用

張金輝※(綜述),封宇(審校)

(重慶警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，重慶 401331)

摘要：作為最常見的人體斑痕類型之一的精斑是法醫(yī)物證檢驗(yàn)的重要步驟，其確認(rèn)往往是性侵犯案件定性的最重要證據(jù)之一，對(duì)混合精斑進(jìn)行分離確證也是證物檢驗(yàn)中的難點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的精斑檢測(cè)主要依靠精子鏡檢、組織化學(xué)方法等方法，但是存在明顯的不足之處。近年來，隨著生物分子水平的迅速發(fā)展，抗原抗體反應(yīng)及基因組學(xué)在精斑鑒定的法醫(yī)實(shí)踐中得到了應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：免疫學(xué)方法；混合精斑；檢驗(yàn)；應(yīng)用

精斑是精液浸潤(rùn)或附著于基質(zhì)上，干燥后形成的斑痕，主要由精子及精漿組成，是一種含蛋白質(zhì)、各種酶及果糖等多種成分的堿性乳白色膠狀液體。精斑是強(qiáng)奸案等性犯罪最重要的證據(jù)之一，對(duì)案件性質(zhì)的確定具有重要的決定性作用。其檢測(cè)方法主要有精子鏡檢、組織化學(xué)方法及免疫學(xué)方法等，各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用的范圍[1]。免疫學(xué)方法是指運(yùn)用抗原抗體反應(yīng)的原理，特異性地對(duì)混合精斑進(jìn)行確認(rèn)的方法。由于免疫學(xué)方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于混合精斑的檢驗(yàn)?，F(xiàn)對(duì)免疫學(xué)方法在混合精斑檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供參考。

1抗前列腺特異性抗原膠體金免疫試紙條

又稱精斑試紙條，是利用免疫學(xué)方法，如免疫電泳、斑點(diǎn)分子雜交法、斑點(diǎn)免疫結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等和色譜層析技術(shù)如薄層免疫測(cè)定等對(duì)前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)(P30)進(jìn)行特異性檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便方法[2]。前列腺特異性蛋白是一種由前列腺分泌的人精液所特有的具有抗原性的糖蛋白，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)已成為確證精斑最有效的方法之一，尤其是對(duì)微量陳舊檢材。該方法具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速、特異性強(qiáng)、靈敏性高、結(jié)果易判讀以及沒有特殊設(shè)備要求等諸多優(yōu)勢(shì)，因此廣泛地應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的實(shí)際精斑確證試驗(yàn)檢案中?？筆30膠體金免疫試紙條是目前我國(guó)法醫(yī)學(xué)檢案中最常用的確證精斑的手段。有研究指出，對(duì)于濃度稀釋至6000倍的精液，采用精斑確證試驗(yàn)獲得的陽(yáng)性結(jié)果依然是比較可信的[3]。為了更加方便、簡(jiǎn)單、快速地應(yīng)用該免疫層析技術(shù)，使其擁有更大的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)有大量成熟的快捷精斑試紙條投放入市場(chǎng)供使用。一般的試紙條的其靈敏度即可達(dá)4000～6000倍，還有的可以精確到萬倍以上[4]。由于廠家的不同，所生產(chǎn)出來的產(chǎn)品在敏感性上也存在差異。臨床上主要的商用試劑條有Bioengine、Chembio、Medpro、SPERM HY-LITER、One Step ABA card、Onco-screen、Seratecl PSA Semiquant和PSA check-1等[5]。在實(shí)際應(yīng)用中，除了規(guī)范操作步驟外，還要避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)。各種具體的實(shí)際情況都可能會(huì)影響到其精確度和敏感性，如檢測(cè)時(shí)精斑浸液過濃、時(shí)間過長(zhǎng)、遭水洗破壞、種屬之間發(fā)生交叉反應(yīng)等，均有可能使結(jié)果出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象[6-7]。另外，文獻(xiàn)報(bào)道，濃度在6.4%以上的NaCl溶液可能會(huì)使該反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)?？梢姡瑐鹘y(tǒng)的精斑確證方法在多個(gè)方面(敏感性、特異性、實(shí)用性)等均存在著一些缺陷，有必要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

2信使RNA

個(gè)體一般存在兩種不同類型的基因，一種為管家基因，廣泛存在于所有組織中的細(xì)胞，負(fù)責(zé)細(xì)胞功能的維持。另一種基因稱為非管家基因，指專一性地表達(dá)于特定組織，比如人體的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞、精子等終末分化細(xì)胞的形成就由這種特定基因的關(guān)閉或開啟決定[8]。RNA在不同功能和不同類型的組織或細(xì)胞中的表達(dá)模式存在差異。如果對(duì)斑痕的信使RNA(mRNA) 的種類進(jìn)行分型確定，就可以識(shí)別其組織來源。mRNA檢測(cè)的步驟通常如下：首先采用Trizol法對(duì)樣本RNA進(jìn)行提取和收集，接著用 DNase I對(duì)mRNA 進(jìn)行消化，加入逆轉(zhuǎn)錄所需要的核苷酸分子后，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA，最后采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大量的產(chǎn)物及對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序等[9]。由于RNA 酶廣泛存在于細(xì)胞和環(huán)境中，離體后被迅速降解，故一般認(rèn)為mRNA 是極其不穩(wěn)定的，不可能作為理想的法醫(yī)分子標(biāo)記。但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，RNA在干燥斑痕中的穩(wěn)定性得到證實(shí)。而且基因組和逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用也使RNA作為法醫(yī)證據(jù)檢測(cè)方法得到實(shí)現(xiàn)。但是在實(shí)際應(yīng)用中，仍然需要謹(jǐn)慎的對(duì)待逆轉(zhuǎn)錄PCR 出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)陰性結(jié)果，因?yàn)?RNA穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上DNA，各種不適應(yīng)的保存環(huán)境、對(duì)RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄的過程中操作不當(dāng)均容易導(dǎo)致 mRNA 的降解，進(jìn)而出現(xiàn)陰性結(jié)果。可以說，利用組織特異性RNA進(jìn)行斑痕檢測(cè)已經(jīng)成為目前法醫(yī)學(xué)科斑痕標(biāo)記研究的熱點(diǎn)之一[10]。

自1989年P(guān)essot等[11]首次在實(shí)驗(yàn)室對(duì)成熟精子mRNA 進(jìn)行檢測(cè)以來，已經(jīng)有很多實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)的研究。Bauer和Patzeh[12]于2003年首次證明，成熟精子的核蛋白魚精蛋白1 和2是特異性的精子標(biāo)志物，對(duì)包括血液、陰道拭子、唾液和人體組織等不含精子的樣本的魚精蛋白1和魚精蛋白2檢測(cè)均呈陰性，表明核蛋白魚精蛋白1和魚精蛋白2適合作為精子的標(biāo)志物。2006年，Nussbaumer等[13]采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過mRNA檢測(cè)進(jìn)行了體液斑鑒定的研究。2008年，Haas等[14]采用與精子標(biāo)志物魚精蛋白1 和 魚精蛋白2對(duì)放置15個(gè)月的精斑進(jìn)行檢測(cè)，檢出結(jié)果為陽(yáng)性。此后，越來越多的基于檢測(cè)mRNA的體液斑確證方法研究陸續(xù)被報(bào)道出來。

相對(duì)傳統(tǒng)精斑確證試驗(yàn)而言，利用mRNA進(jìn)行精斑標(biāo)記具有特異性強(qiáng)、敏感性高、干擾少、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。但mRNA的檢測(cè)需要用到PCR擴(kuò)增儀等比較大型的儀器，只能在特定的實(shí)驗(yàn)室操作完成，需要經(jīng)過專門培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員，消耗的耗材也相對(duì)比較昂貴，而且mRNA也比較容易酶解，這一定程度上也限制了其應(yīng)用。

3微RNA

微RNA(microRNA，miRNA)是一種長(zhǎng)度為18～23 nt的單鏈非編碼小分子RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)且長(zhǎng)度為70～90 nt的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶切后生成[15]。Hanson等[16]指出，mRNA一般其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度比較長(zhǎng)，容易斷裂，具有一定的缺陷。他們?cè)?51個(gè)miRNA基因座中篩選出9個(gè)在某一種體液中表達(dá)較高而在其他體液中不表達(dá)或表達(dá)較低的miRNA標(biāo)記(miR-10b、miR-16、miR-124a、miR-135b、miR-205、miR-372、miR-412、miR-451和miR-658)，其中2個(gè)標(biāo)記成功(miR-10b及miR-135b)應(yīng)用于精斑的檢測(cè)。此后有許多具有組織特異性的miRNA被相繼識(shí)別。

4DNA甲基化

隨著后基因組時(shí)代的到來，法醫(yī)DNA分析技術(shù)在法醫(yī)鑒定中的作用越來越重要。DNA甲基化由于其具體的特異性和穩(wěn)定性已經(jīng)成為目前最為理想的法醫(yī)分子標(biāo)記[17]。DNA 甲基化主要是指DNA復(fù)制后主要在CpG二核苷酸的胞嘧啶上進(jìn)行共價(jià)修飾而成的核酸。這種修飾不改變 DNA 的序列，但可以對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在分化的體細(xì)胞，基因組甲基化模式通常是穩(wěn)定、可遺傳的[18-19]。組織之間廣泛存在的甲基化差異位點(diǎn)理論上均可以作為候選的斑痕標(biāo)記。DNA 甲基化的發(fā)現(xiàn)為研究者在 DNA 水平進(jìn)行斑痕鑒別提供了可能。2005年，趙貴森和楊慶恩[20]首次提出了根據(jù) DNA 甲基化進(jìn)行法醫(yī)組織斑痕鑒別的思路。2012年，劉峰等[21]采用DNA IQTM System試劑盒成功檢驗(yàn)了1例精斑。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，已經(jīng)有越來越多的采用DNA甲基化原理的試劑盒被應(yīng)用到精斑的檢測(cè)中[22-24]。DNA甲基化由于其穩(wěn)定的理化性質(zhì)，以及高敏感性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，越來越顯示出具有廣闊應(yīng)用前景的新型分子標(biāo)記。

5免疫磁珠技術(shù)

通過將特異性的抗體與磁性微球進(jìn)行偶聯(lián)，利用磁性分離技術(shù)，可達(dá)到對(duì)精陰混合斑中精子進(jìn)行捕獲和檢測(cè)。免疫磁珠技術(shù)具備其他方法所缺少的固相化試劑的優(yōu)點(diǎn)。目前，精子特異性抗原對(duì)應(yīng)的單克隆抗體及多克隆抗體已經(jīng)有商品化的試劑可以購(gòu)買，同時(shí)免疫磁珠結(jié)合配基的技術(shù)發(fā)展也已經(jīng)十分成熟。2007年Anslinger等[25]針對(duì)精子表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗原篩選出3種抗體1E10、4E3和4E10制備免疫磁珠，并且成功進(jìn)行了分離。2011年國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了初步研究，利用人精子魚精蛋白抗體和抗SPAG8抗體成功對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行的捕獲和分離?？梢哉f，免疫磁珠技術(shù)由于具備了抗原抗體的高特異性和其本身固有的固化性，具有較好的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[26]。

6其他

精液特異性抗原可被單克隆抗體MHS-5(精囊腺上皮細(xì)胞分泌的特異蛋白質(zhì))識(shí)別，其具有很高的靈敏度，但是特異性不如PSA試驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。其他用于精液檢測(cè)的抗原主要有單克隆抗體1E5、精液凝固蛋白 Ⅱ、19-OH F1a/F2a前列腺素等。

7小結(jié)

精斑是法醫(yī)實(shí)踐中常見的物證檢材。在強(qiáng)奸、猥褻等案件中，對(duì)精斑的檢驗(yàn)可以為案件的偵查提供線索，為分析、審理案件提供證據(jù)。隨著犯罪手法的日益復(fù)雜，對(duì)微量精斑鑒別提出了更高的技術(shù)要求。傳統(tǒng)的鏡檢精斑已經(jīng)無法滿足法醫(yī)學(xué)的需求。應(yīng)用免疫學(xué)原理，在核酸分子水平進(jìn)行的精子特異性的分子標(biāo)記，高度靈敏、特異、結(jié)果可靠，有望成為未來進(jìn)行斑痕確證的主要方法。但是，利用核酸分子水平進(jìn)行精斑鑒別目前還不是很成熟，還處于起步階段，進(jìn)行法庭提供證據(jù)，還需要輔助采用其他較為成熟的檢驗(yàn)方法。

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The Application of Immunological Method on the Identification of Mixed Seminal StainsZHANGJin-hui,FENGYu.(DepartmentofCriminalScienceandTechnology,ChongqingPoliceAcademy,Chongqing401331,China)

Abstract：The authentication of seminal stains is one of the important means in forensic tests.Being one of the most important decisive evidence among the crimes of rape,the authentication of mixed seminal stains is usually enormously difficult.Traditional identification of seminal stains mainly relies on the microscopic identification of spermatozoa,histochemical method,which still have defects.With the development of biological molecular level,antigen antibody reaction and genomics have been applied to semen stain identification.

Key words：Immunology; Mixed seminal stains; Identification; Application

收稿日期：2015-01-12修回日期：2015-04-24編輯：相丹峰

基金項(xiàng)目：重慶市公安局科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2012-10)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.007

中圖分類號(hào)：R331； R89

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)22-4051-03