電化學(xué)DNA生物傳感器的指示方法及其臨床研究進(jìn)展

張　澤，萬(wàn)廣財(cái)，王　娜，于洪偉(綜述)，常　東(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150001)

電化學(xué)DNA生物傳感器的指示方法及其臨床研究進(jìn)展

張澤△，萬(wàn)廣財(cái)△，王娜△，于洪偉△(綜述)，常東※(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150001)

摘要：電化學(xué)DNA生物傳感器是很有前景的核酸分析技術(shù)，由于它操作簡(jiǎn)便快速、信號(hào)靈敏，能與DNA生物芯片兼容等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注，成為當(dāng)今生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題。它利用雜交原理及電化學(xué)標(biāo)志物為雜交檢測(cè)信號(hào)，既可以用標(biāo)記法又可以用非標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)，不受顏色影響，可對(duì)痕量樣品測(cè)定，儀器設(shè)備易于集成化和自動(dòng)化且價(jià)格低廉，正朝向便攜式商業(yè)化方向發(fā)展。實(shí)現(xiàn)電化學(xué)DNA生物傳感器的準(zhǔn)確檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中所用到的指示方法發(fā)揮很大作用。該文著重闡述在DNA傳感器工作中所運(yùn)用的指示方法以及其在臨床中的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：DNA；電化學(xué)活性； 雜交

DNA生物傳感器作為一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)特定DNA序列的方法引起了廣泛的關(guān)注，通常情況下，通過(guò)與互補(bǔ)鏈雜交來(lái)檢測(cè)特定DNA序列，雜交能引起信號(hào)轉(zhuǎn)換器的變化，因此，捕捉雜交前后的信號(hào)變化來(lái)判斷DNA雜交反應(yīng)情況。電化學(xué)檢測(cè)DNA的方法大多數(shù)需要一些標(biāo)記元素，將雜交信息放大轉(zhuǎn)化為可測(cè)的電化學(xué)信號(hào)，如氧化活性分子，它能對(duì)單鏈和雜交后的雙鏈加以區(qū)分，標(biāo)志物可以吸附于探針上[1]、檢測(cè)鏈上或添加到溶液中[2]；還有一些無(wú)標(biāo)記[3]的方法也被廣泛應(yīng)用，既可以依靠靶DNA的直接電化學(xué)特性，又可以依賴DNA雜交之后界面電性能的變化進(jìn)行檢測(cè)。因此，DNA電化學(xué)傳感器的雜交指示方法是此類(lèi)傳感器的關(guān)鍵性問(wèn)題，現(xiàn)主要介紹標(biāo)記和非標(biāo)記的DNA電化學(xué)檢測(cè)方法及臨床研究進(jìn)展。

1有標(biāo)記DNA電化學(xué)檢測(cè)

有標(biāo)記的方法主要是指通過(guò)吸附、化學(xué)修飾或生物親和等把一些具有電化學(xué)活性或催化活性的無(wú)機(jī)或生物粒子等固定在DNA片段上，通過(guò)檢測(cè)修飾粒子本身或其催化底物的信號(hào)來(lái)指示雜交過(guò)程。在電化學(xué)DNA生物傳感器中，標(biāo)記型雜交指示劑通常是典型的氧化還原活性分子，能插入雙鏈DNA分子中，且不會(huì)對(duì)單鏈DNA造成很大影響；或者這些分子能優(yōu)先綁定在單鏈或雙鏈DNA上。也有一些已經(jīng)報(bào)道的標(biāo)記元素，如酶、納米微粒、脂質(zhì)體等。

1.1電化學(xué)活性物質(zhì)DNA從靈活的單鏈DNA到相對(duì)僵硬雙鏈DNA的變化可以用標(biāo)記的方法檢測(cè)，同樣，也可以用非標(biāo)記的方法檢測(cè)。電活性DNA標(biāo)志物是一類(lèi)電活性較好的物質(zhì)，它們通過(guò)化學(xué)鍵合作用直接或間接地連接在ssDNA鏈末端，制成帶有標(biāo)記的ssDNA探針。如二茂鐵和亞甲藍(lán)是電化學(xué)活性物質(zhì)，是在DNA電化學(xué)生物傳感器中常用的指示劑，將二茂鐵標(biāo)記到探針的末端，由于單鏈DNA相對(duì)靈活，可以使二茂鐵更接近電極表面，因此可以被氧化還原。然而，雜交之后，雙鏈DNA立于電極表面，增加了從電極到二茂鐵的電子轉(zhuǎn)移距離，使信號(hào)發(fā)生改變，變化的信號(hào)量與雜交程度呈現(xiàn)一定比例關(guān)系，因此，可以檢測(cè)雜交量。與二茂鐵相比，亞甲藍(lán)穩(wěn)定性較好，且在高濃度的氯化物中能更好地發(fā)揮作用。Lai等[4]進(jìn)一步發(fā)展了這一實(shí)驗(yàn)方法，把莖環(huán)探針固定于金電極表面，莖環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是它部分為自身雜交，使標(biāo)志物亞甲藍(lán)能更為貼近金電極表面，并且發(fā)出較好的電化學(xué)信號(hào)。

1.2酶在檢測(cè)雜交反應(yīng)中，常將具有氧化還原活性的酶標(biāo)記在DNA探針上，利用酶的催化放大功能來(lái)進(jìn)行間接測(cè)定的方法。當(dāng)DNA探針與靶DNA雜交后，這些酶與其對(duì)應(yīng)的底物發(fā)生催化作用，產(chǎn)生的電信號(hào)被用于靶DNA的分析。辣根過(guò)氧化物酶就是一種作為標(biāo)志物的電化學(xué)指示劑，Zhang等[5]用電化學(xué)酶放大夾心法檢測(cè)38個(gè)堿基的DNA序列，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記于探針末端。通常檢測(cè)探針會(huì)帶有放射性的標(biāo)記，或產(chǎn)生光學(xué)、電化學(xué)等標(biāo)記。

1.3金屬納米顆粒納米技術(shù)的出現(xiàn)為各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域提供了新的發(fā)展前景。納米微粒具有大比表面積、高活性、極微小性等特點(diǎn)，與傳感器所要求的多功能、微型化相匹配。DNA探針標(biāo)記有金屬(常用的是金、銀、鉑)納米顆粒，再與目標(biāo)DNA雜交后，通過(guò)特定處理得到相應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)。以納米金為例，它能迅速、穩(wěn)定地吸附核酸、蛋白質(zhì)等生物分子，而且這些生物分子的生物活性幾乎不會(huì)發(fā)生改變，所以納米金具有優(yōu)良的生物相容性，可以作為生物分子的載體。金本身是非常優(yōu)良的導(dǎo)電材料，具有優(yōu)異的電化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)又具有較好的電活性，可作為電化學(xué)DNA傳感器的雜交指示劑。Authier等[6]將納米金應(yīng)用到定量檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒，用金納米探針與人巨細(xì)胞病毒的單鏈DNA(人巨細(xì)胞病毒 DNA)進(jìn)行雜交反應(yīng)，采用陽(yáng)極溶出伏安法測(cè)定溶解得到的金離子，間接測(cè)定DNA含量。

1.4脂質(zhì)體脂質(zhì)體是一種球型的小囊泡，以水為中心，磷脂雙分子層包繞而成[7-8]，脂質(zhì)體的內(nèi)部空穴可以用來(lái)貯存酶、蛋白、DNA、藥物或其他物質(zhì)[9]，形成有標(biāo)記的脂質(zhì)體，用于DNA的檢測(cè)。對(duì)于脂質(zhì)體的研究不斷發(fā)展，已經(jīng)從傳統(tǒng)的小囊泡發(fā)展到通過(guò)調(diào)整脂質(zhì)組成、大小和囊泡的量獲得有長(zhǎng)循環(huán)的第二代脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的薄膜可以被各種生物活性物質(zhì)修飾，以獲得特效的活性，大部分脂質(zhì)體膜修飾物有寡聚核苷酸鏈、抗體、蛋白受體、放射性標(biāo)志物[10-12]等，鑒于脂質(zhì)體的諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被用于電化學(xué)領(lǐng)域，達(dá)到擴(kuò)大電化學(xué)信號(hào)的目的。目前的研究把脂質(zhì)體看作是能樹(shù)狀放大DNA感應(yīng)的微粒子構(gòu)建元件，提供了一個(gè)骨架結(jié)構(gòu)。Nejdl等[13]將Zn(Ⅱ)包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，金納米粒固定于脂質(zhì)體外側(cè)，該研究成功地說(shuō)明脂質(zhì)體適用于Zn(Ⅱ)和核酸的傳送，未來(lái)可以用于靶定和控制腫瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及阻止病毒的繁殖。

2非標(biāo)記DNA電化學(xué)檢測(cè)

2.1DNA分子自身電化學(xué)活性相對(duì)于有標(biāo)記的方法來(lái)說(shuō)，非標(biāo)記的方法有很多優(yōu)勢(shì)，它無(wú)需對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記就能簡(jiǎn)單、快速地直接檢測(cè)雜交反應(yīng)，對(duì)DNA的活性或折疊等產(chǎn)生較小影響。目前，構(gòu)建簡(jiǎn)單、低成本、無(wú)需標(biāo)記的檢測(cè)方法是DNA生物傳感器的發(fā)展趨勢(shì)。非標(biāo)記的方法基于DNA本身的電活性或依賴于界面電性能的變化，即雜交后ss-DNA變?yōu)閐s-DNA時(shí)引起的電極界面電性能改變。前者主要是指鳥(niǎo)嘌呤的電化學(xué)氧化的變化[14]，因?yàn)镈NA分子本身具有一定的電活性，主要是由DNA堿基所引起，其中鳥(niǎo)嘌呤是最容易發(fā)生氧化反應(yīng)的堿基，可以在大多數(shù)電極上產(chǎn)生氧化還原峰，再者由于它的簡(jiǎn)便性和多功能性，在非標(biāo)記的方法中很受歡迎。Pantos等[15]將磺基水楊酸和單鏈DNA通過(guò)電聚合作用修飾到玻碳電極上，利用差分脈沖伏安法，非標(biāo)記成功地同時(shí)檢測(cè)腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。

2.2電活性小分子以非標(biāo)記型電活性小分子雜交指示劑作為識(shí)別元素，它與雙鏈DNA結(jié)合的能力強(qiáng)于單鏈DNA，單鏈DNA與電活性小分子之間為靜電作用，而雙鏈DNA是靜電作用與內(nèi)部疏水作用相結(jié)合，因此可以對(duì)兩者進(jìn)行區(qū)分?，F(xiàn)在常見(jiàn)的染料雜交指示劑有亞甲藍(lán)、燦爛甲酚藍(lán)、吖啶酮衍生物等。亞甲藍(lán)在標(biāo)記型雜交指示劑中的應(yīng)用，同樣，也可以作為非標(biāo)記型雜交指示劑的識(shí)別元素。Liu等[16]合成一種聚噻吩和亞甲藍(lán)的混合物作為一種電化學(xué)DNA雜交指示劑，完全雜交后，亞甲基藍(lán)功能化的聚噻吩使電流增加，相比單獨(dú)的亞甲藍(lán)指示劑，亞甲基藍(lán)功能化的聚噻吩對(duì)緩沖液濃度的變化有更好的抵抗作用。亞甲藍(lán)較為常用，本科研組也做過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[17]。

2.3金屬配合物金屬配合物作為一種DNA靶向分子應(yīng)用廣泛[18]。它可以與DNA的堿基或磷酸骨架相結(jié)合，并且能嵌入到雙鏈DNA的溝槽內(nèi)，發(fā)生靜電作用。王茂清等[19]將DNA探針固定于鉑納米顆粒的玻碳電極上，以鄰菲咯啉合鈷[Co(phen)3]3+作為雜交指示劑，用方波伏安法進(jìn)行檢測(cè)，雜交后信號(hào)變大。

2.4DNA分子小溝結(jié)合劑上述所說(shuō)的電活性小分子和金屬絡(luò)合離子在非標(biāo)方法中以嵌入劑的形式發(fā)揮作用，雖然它們無(wú)需標(biāo)記過(guò)程，但是它們既可以與單鏈DNA結(jié)合，同時(shí)又能與雙鏈DNA相結(jié)合。再者，它們易從雙鏈DNA分子上脫落，電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)受到影響，靈敏度降低。要使非標(biāo)記檢測(cè)方法更加靈敏可靠，雜交指示劑起到很重要的作用，DNA分子小溝結(jié)合劑與嵌入劑相似，但它與DNA分子結(jié)合方式和嵌入劑不同，它是與雙鏈DNA的小溝相結(jié)合，而不是嵌入雙鏈DNA分子堿基中，因此，選擇性更加良好，這類(lèi)物質(zhì)有紡錘菌素、抗腫瘤抗生素CC-1065、博來(lái)菌素、二苯并酰亞胺類(lèi)染料[20]。

2.5電化學(xué)阻抗法非標(biāo)記方法被擴(kuò)展到用電化學(xué)阻抗法檢測(cè)[18,21-23]，該方法是檢測(cè)從單鏈修飾的電極到雜交之后感應(yīng)電流阻抗的變化，由于雙鏈負(fù)電荷增加，電荷交換的阻力也隨之增加，電化學(xué)阻抗法已經(jīng)證實(shí)對(duì)于電極表面生物識(shí)別和有功能的生物材料特性方面是一種有效且敏感的方法。目前，電化學(xué)阻抗法已經(jīng)用于導(dǎo)電聚合物或金納米顆粒修飾的肽核酸/DNA生物傳感器中[24-25]。

3臨床研究進(jìn)展

臨床檢驗(yàn)與其他一些化學(xué)檢驗(yàn)或測(cè)量有所不同，首先是樣品高度復(fù)雜，因?yàn)榕R床中的樣本取自于患者本身，同時(shí)受到來(lái)自外界和自身的多種因素影響；其次，樣本數(shù)量巨大，時(shí)效要求較高，因此發(fā)展和應(yīng)用微量、簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化的方法是臨床檢驗(yàn)工作者一直尋求的。目前輔助臨床診斷的一些檢測(cè)方法需要經(jīng)過(guò)相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間才能取得結(jié)果，然而，運(yùn)用電化學(xué)生物傳感器能在很大程度上縮短臨床檢測(cè)時(shí)間，提高臨床檢測(cè)的時(shí)效性。目前已研制出的可以檢測(cè)血糖、尿酸、人絨毛膜促性腺激素、細(xì)菌毒素等的生物傳感器。

許多遺傳性疾病是由于基因的異常表達(dá)或基因序列突變引起的，雖然在過(guò)去的幾年里，關(guān)于疾病診斷的試驗(yàn)和技術(shù)不斷發(fā)展，但是對(duì)于基因相關(guān)疾病的早期診斷并不理想，電化學(xué)DNA傳感器結(jié)合DNA雜交原理，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)潛在的危險(xiǎn)因素，是目前診斷基因相關(guān)疾病的熱點(diǎn)。Mohan等[26]用電化學(xué)阻抗法以無(wú)標(biāo)記的方法檢測(cè)乳腺癌1號(hào)基因，雜交前后，阻抗圖譜明顯變化，檢測(cè)限達(dá)1×10-17mol/L。

DNA生物傳感器還可用于研究抗腫瘤藥物的作用機(jī)制。Brett 等[27]用修飾有雙鏈DNA的玻碳電極來(lái)研究鹽酸米托蒽醌與DNA相互作用的機(jī)制，結(jié)果表明，鹽酸米托蒽醌能破壞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，從而抑制核酸合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

4展望

近年來(lái)，電化學(xué)生物傳感器越來(lái)越備受關(guān)注，尤其是在尋找新的電極修飾材料、新的指示劑、新的檢測(cè)方法方面可進(jìn)一步提高傳感器性能。電化學(xué)DNA生物傳感器的指示方法無(wú)論是標(biāo)記的方法還是無(wú)標(biāo)記的方法，都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，標(biāo)記的方法雖然靈敏度較高，但是對(duì)探針的預(yù)處理易對(duì)DNA的活性或折疊等產(chǎn)生影響；無(wú)標(biāo)記的方法雖然簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，但是靈敏度不如標(biāo)記的方法。因此，要加緊研究兼顧兩者優(yōu)點(diǎn)的電化學(xué)DNA生物傳感器。

雖然電化學(xué)生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)突出，但至今商品化程度還不高，其原因是電化學(xué)生物傳感器存在一些不足。盡管如此，它的發(fā)展前景仍十分樂(lè)觀，依托現(xiàn)在生物技術(shù)(如聚合酶鏈反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、芯片技術(shù)等)提升傳感器的適應(yīng)性和穩(wěn)定性，制造出便攜、快速、靈敏的生物傳感器。未來(lái)生物傳感器的發(fā)展方向如下：首先，實(shí)現(xiàn)傳感器的小型化，使之便于攜帶，能滿足床前采樣的需求；其次，可以與其他檢測(cè)方法相結(jié)合，提高靈敏度；最后，實(shí)現(xiàn)多樣品多組分自動(dòng)化檢測(cè)，用一種標(biāo)志物對(duì)多種組分進(jìn)行檢測(cè)，提高電極的檢測(cè)效率。隨著生物醫(yī)學(xué)傳感器的不斷發(fā)展，它必將成為現(xiàn)代醫(yī)療設(shè)備的重要組成部分，在醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)中發(fā)揮巨大作用。

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The Indicating Methods of DNA Electrochemical Sensor and Progress of Clinical ResearchZHANGZe,WANGuang-cai,WANGNa,YUHong-wei,CHANGDong.(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:DNA electrochemical biosensor is a very promising nucleic acid analysis technology,which is a novel and developing technique combining biochemical,electrochemical,medical and electronic techniques with the advantages of being simple,reliable, cheap,sensitive,selective for genetic detection and convenience for integration and microminiaturization,and has been a hot topic in the field of biochemistry and medicine.DNA electrochemical biosensor are commonly employed to detect specific sequences of DNA.The transduction strategies can be subdivided into two main categories,labeled and label-free approaches.At present,it is developing toward the direction of portable commercial devices.Here is to make a review of the the indicating methods of DNA biosensors and the research development in the clinical application.

Key words:DNA; Electrochemical activity; Hybridization

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-03-30編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81273129)；黑龍江省自然科學(xué)基金(D201174)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.002

中圖分類(lèi)號(hào)：R-331

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)22-4036-03