食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的分類與進展

韋宏珍

廣西武鳴縣疾病預(yù)防控制中心　530199

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食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的分類與進展

韋宏珍

廣西武鳴縣疾病預(yù)防控制中心530199

摘要金黃色葡萄球菌是人類一種重要的病原菌，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起人類食物中毒和許多嚴(yán)重感染，因此對于金黃色葡萄球菌的檢測有重要意義，本文對其檢測方法進行了分析，并對其研究的現(xiàn)代進展進行論述。

關(guān)鍵詞金黃色葡萄球菌檢測方法進展

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)是一種常見的病原微生物，它廣泛分布在自然界，包括空氣、水以及動物的排泄物中。S.aureus能分泌20多種毒性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生腸毒素、殺白細胞素等多種毒素以及多種酶類，容易引起人和動物化膿感染、人食物中毒。S.aureus會通過食品的加工、包裝及運輸過程污染食品，其分泌的毒素對熱的抵抗力很強，加熱煮沸30min仍能致病。在美國，由S.aureus引起的食物中毒占全部細菌性食物中毒的33%，加拿大更是占到了45%[1]，而在我國則有25%[2]。因此，S.aureus為我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗常規(guī)檢測項目之一[3]。為加強食品中S.aureus的檢測及食物中毒的預(yù)防和控制，本文對目前S.aureus檢測方法的研究進展進行綜述，旨在為從事S.aureus檢驗的工作人員提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)。

1S.aureus傳統(tǒng)檢驗法

食品中S.aureus的檢驗方法[3]：無菌取樣25g(ml)，加入225ml 7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中均質(zhì)，制成10-1稀釋液，將10-1稀釋液(36±1)℃培養(yǎng)18～24h;將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線Baird-Parker平板和血平板，(36±1)℃分別培養(yǎng)18～48h、18～24h，挑取Baird-Parker平板上圓形顏色呈灰至黑色、周圍有一渾濁帶、外層有一透明圈和血平板上金黃色或白色、周圍有溶血圈的菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

2S.aureus快速檢測法

2.1紙片法快速測試片是較常用的一種方法，用紙片、膠片、膜等作為培養(yǎng)基載體，添加特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)，通過觀察微生物的生長、顯色來測定食品中的微生物[4,5]。紙片測試的方法操作簡單方便，便于運輸攜帶方便，其缺點是耗時長、無法準(zhǔn)確定性和計數(shù)。

2.2S.aureus顯色培養(yǎng)基是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)而顯色的新型培養(yǎng)基。通過將目標(biāo)微生物特征性酶的顯色底物加入到選擇性培養(yǎng)基中，當(dāng)目標(biāo)微生物生長時，其特征性酶表達進而與底物反應(yīng)并形成有顏色的代謝物，而干擾菌的生長受到抑制或不產(chǎn)生相應(yīng)的酶，與底物不反應(yīng)而不顯色，因而根據(jù)菌落顏色進行辨別。該方法具有靈敏性、特異性和選擇性。根據(jù)菌落顏色就可鑒定菌種，不需要補充試驗[6~8]。目前常用于S.aureus顯色培養(yǎng)基主要有培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B和PEN-TCF，其中A和PEN-TCF的回收率較高，而B抗干擾能力稍強[9]。

3免疫學(xué)方法

免疫學(xué)檢測S.aureus的方法主要有:(1)乳膠凝集試驗，通過使用含單克隆抗體的乳膠凝集試驗可以簡單、快捷鑒定S.aureus。新開發(fā)的Slidex staph.plus乳膠試劑，對于S.aureus的檢測靈敏度較高，尤其對耐甲氧西林和甲氧西林敏感的S.aureus，檢測僅需數(shù)分鐘，是一種簡便快速度的檢測方法。(2)血漿凝固酶試驗，S.aureus可以產(chǎn)生血漿凝固酶，將血漿中纖維蛋白變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，生成凝塊。血漿凝固酶試驗可以判定菌株是否具有致病力，常用于鑒定S.aureus和其他葡萄球菌。

4分子生物學(xué)方法

4.1PCR法作為主要的分子生物學(xué)方法，1985年由Mullis等創(chuàng)立，不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，PCR法對活菌和受損菌以及死菌均可檢測，是一種以變性、退火、延伸為基本步驟的體外外快速擴增特異目標(biāo)基因的技術(shù)，也被稱為基因的體外擴增法[10]。此方法具有迅速準(zhǔn)確的優(yōu)點，但儀器設(shè)備較昂貴，技術(shù)要求較高，對實驗室條件要求較高，不適用于一般實驗室。同時，普通PCR產(chǎn)物還會引起污染，增加假陽性結(jié)果，反應(yīng)中添加的溴化乙錠具有較強的致癌性，會引起健康問題。

4.2熒光定量PCR法1996年，美國Applied Biosystems公司推出的新定量試驗技術(shù)，使用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合軟件可對產(chǎn)物進行定量分析的方法。謝曉紅等對于熒光定量法對食源性疾病的研究[11]，發(fā)現(xiàn)其靈敏度達4~8CFU/ml，是普通PCR靈敏度的10倍、常規(guī)培養(yǎng)的1 000倍，本方法具有操作簡單快速、高特異和高靈敏的特點。

4.3環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法其廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，主要包括病毒、細菌和真菌等檢測[12~18]。根據(jù)靶目標(biāo)序列上的特異區(qū)域設(shè)計引物，在恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，通過形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)及鏈置換，對目標(biāo)DNA進行大量擴增并形成多種片段DNA產(chǎn)物的一種新型核酸擴增方法。該方法具有高效、特異、快速等特點。

5腸毒素檢測

S.aureus病原性是由攜帶的腸毒素引起的。金黃色葡萄球菌其耐熱性較差，在常規(guī)加熱的情況下即可殺滅病菌，而腸毒素的耐熱性較強。因此，國際上食品檢驗的法規(guī)中將腸毒素的檢測納入。根據(jù)檢測原理分為三種：動物實驗法、免疫血清學(xué)方法，核酶擴增法。

5.1動物實驗法以幼貓為研究對象，在食物中毒患者的剩余食物、嘔吐物或者糞便做細菌分離鑒定的同時，將其接種在肉湯培養(yǎng)基中，在6~8周齡的幼貓腹腔中注射孵育后取出的濾液，在注射4h后，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、體溫升高或者死亡的情況，提示存在腸毒素的可能。其優(yōu)點是觀察結(jié)果準(zhǔn)確、判定直觀，缺點是動物的來源困難及靈敏度較差。

5.2免疫血清學(xué)方法在食品衛(wèi)生檢驗中S.aureus腸毒素免疫血清學(xué)方法是一種以腸毒素為抗原，生產(chǎn)相應(yīng)特異性抗體，通過結(jié)合性反應(yīng)發(fā)生，形成可見沉淀為原理的檢測方法。包括免疫瓊脂擴散法、反向間接血凝試驗法、反向被動乳膠凝集試驗法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光檢測法等。酶聯(lián)免疫吸附法是利用酶標(biāo)記的抗原或抗體在固相載體上進行抗原或抗體的測定，具有高靈敏度、操作簡便、反應(yīng)迅速、無特殊設(shè)備的優(yōu)點，目前已有商品化的試劑盒，其缺點是易引起交叉反應(yīng)造成假陽性。

5.3核酶擴增法針對細菌的核酸而發(fā)展起來的基因分型檢測方法，包括常規(guī)PCR法、熒光定量PCR法和LAMP技術(shù)。PCR法可診斷基因水平并大量樣品進行檢測，可直接應(yīng)用于檢測S.aureus的產(chǎn)毒基因。張嚴(yán)峻等[19]運用PCR方法檢測從患者中分離的80株S.aureus，得到9株基因型，腸毒素攜帶率為85.0%，具有2種以上毒素基因的菌株占76.3%；食品中分離得到51株S.aureus，檢測到7種基因型，腸毒素攜帶率為68.7%，具有2種以上毒素基因的菌株占21.6%。與傳統(tǒng)培養(yǎng)或免疫學(xué)方法相比，PCR技術(shù)具有高敏感性、強特異性、高重復(fù)性、高自動化程度等特點，可提供快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，但也受到食品基質(zhì)、培養(yǎng)基成分的干擾，殘留食物成分也會影響PCR反應(yīng)，死亡的S.aureus殘留DNA易造成假陽性結(jié)果。熒光定量PCR技術(shù)在一定程度上克服PCR的不足和缺點，它實行封閉式操作、熒光標(biāo)記探針具有更高的特異性、高通量與自動化使其操作簡便、節(jié)省時間，且能處理大樣本量篩查；其缺點主要是昂貴的儀器和試劑，對實驗人員的操作能力要求較高，限制了大規(guī)模的應(yīng)用。

6總結(jié)與展望

上述是檢測S.aureus的常用方法。隨著技術(shù)不斷提高，常規(guī)細菌培養(yǎng)愈發(fā)成熟，已成為基層最常用的方法，但由于操作復(fù)雜、費時，不能做到早期快速診斷。免疫學(xué)方法因其靈敏性和特異性較低，目前還不為廣泛接受。分子生物學(xué)方法雖然快速、敏感性和特異性高，但高檢測費用也限制其在基層實驗室廣泛應(yīng)用。將分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)知識有效結(jié)合檢測和預(yù)防S.aureus引起的食物中毒，并且對食源性疾病的檢測和預(yù)防也有一定的幫助，隨著社會的發(fā)展和現(xiàn)代化的迅猛變化，傳統(tǒng)檢測方式的適應(yīng)性已經(jīng)下降，對于快速檢測方法的研究已成為現(xiàn)代化的需求，對于分子分型的建立，是未來檢測方法的方向和趨勢。

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文章編號：1001-7585(2015)11-1446-03