6-BA 與NAA 的濃度配比對迷迭香愈傷組織生長的影響

徐小萍，謝燕萍，慕堯，鐘春水，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002）

6-BA 與NAA 的濃度配比對迷迭香愈傷組織生長的影響

徐小萍，謝燕萍，慕堯，鐘春水，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002）

以迷迭香愈傷組織為材料，采用2因素3水平完全隨機試驗，在含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中加入不同濃度配比的6-BA和NAA，探討不同濃度6-BA和NAA組合對迷迭香愈傷組織生長的影響。結(jié)果表明，最適于迷迭香愈傷組織增殖的激素配比為0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，培養(yǎng)20 d后，增殖系數(shù)為10.98。

迷迭香；愈傷組織；BA；NAA；增殖

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）別名海洋之露，是唇形科迷迭香屬灌木，性喜溫暖氣候，原產(chǎn)于歐洲和非洲北部地中海沿岸，目前在我國南方大部分地區(qū)和山東栽種，是重要的香料作物。迷迭香作為一種新興的經(jīng)濟植物，因其含有較多的抗氧化活性物質(zhì)，如萜類中的鼠尾草酸、熊果酸，黃酮類及各種有機酸等被廣泛應(yīng)用于植物次生代謝抗氧化物的生產(chǎn)[1]。但迷迭香植株生長緩慢，生物量不大，影響藥用成分的獲取。

采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行迷迭香藥用成分的生產(chǎn)是解決迷迭香生產(chǎn)緩慢的有效途徑。但關(guān)于迷迭香組織培養(yǎng)的報道，國內(nèi)外很少。福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所姚鳳琴等報道了迷迭香葉片愈傷組織的誘導(dǎo)[2]，于巧芝等報道了不同光質(zhì)對迷迭香愈傷組織生長狀況的影響[3]；此外，劉明家報道了迷迭香組培材料迷迭香酸和鼠尾草酸含量的測定[1]。前人的研究中，愈傷組織的增殖條件優(yōu)化還不夠理想，關(guān)于不同激素濃度組合對愈傷組織增殖的影響還缺乏較系統(tǒng)深入的研究。姚鳳琴[2]的研究認為，2，4-D的濃度以1.0 mg/L為宜，但對于常見激素NAA和BA對愈傷組織增殖的影響，未做比較分析。鑒于此，該試驗在姚風(fēng)琴研究的基礎(chǔ)上，參照其他類似研究結(jié)果[1-6]，通過在含1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中添加不同濃度配比的6-BA和NAA，探究有利于迷迭香愈傷組織增殖的最佳組合，以便大量增殖迷迭香愈傷組織，為后續(xù)提取迷迭香愈傷組織中的藥

用次生代謝物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

迷迭香愈傷組織，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的繼代。參照姚鳳琴的方法，迷迭香愈傷組織分別在含 1.0 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L KT+5.0 mg/L AgNO3的MS固體培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)[2]。

1.2.2 不同6-BA與NAA濃度配比處理。采用2因素3水平完全隨機試驗，在含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中添加不同濃度配比的6-BA和NAA（培養(yǎng)基pH 5.8，蔗糖20 g/L，瓊脂7 g/L），試驗設(shè)計如表1所示，共9個處理。每個處理接10瓶，每瓶接4團大小長勢均勻的愈傷組織，3次重復(fù)。培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計愈傷組織增殖系數(shù)，并采用Leica數(shù)碼顯微系統(tǒng)進行顯微觀察、拍照。

表1 迷迭香愈傷組織完全隨機試驗不同激素水平處理

1.2.3 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光質(zhì)LED白光，光照時間為12 h/d。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

愈傷組織增殖系數(shù)=接種后愈傷組織鮮重（g）/接種前愈傷組織鮮重（g）

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對外觀形態(tài)和增殖的影響

培養(yǎng)20 d后，9個處理的迷迭香愈傷組織生長狀態(tài)如圖1所示。其中處理1為空白對照，愈傷組織質(zhì)地松散，呈白色不透明塊狀；與處理1相比，處理2、3的愈傷組織外觀為淡黃色，呈松散透明塊狀，生長狀態(tài)較好，生長量較大；處理7、8、9愈傷組織外觀稍有褐化，質(zhì)地緊實塊狀，生長狀態(tài)較差；處理4、5、 6愈傷組織的生長狀態(tài)最差，呈水潤緊實塊狀，生長量也較低。

不同處理下迷迭香愈傷組織的增殖情況及各處理間兩兩比較的結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，處理2為含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中單獨添加0.5 mg/L NAA，該處理下迷迭香愈傷組織增殖系數(shù)最大，為10.98，和其他各處理均有顯著性差異，與除處理1（對照）以外的其他處理均有極顯著差異；處理6與處理7無顯著性差異；處理4、7有顯著性差異；處理6和處理9有顯著性差異。綜上所述，最適合迷迭香愈傷組織生長的培養(yǎng)基組合為MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA。

從表2可看出，各因素對迷迭香愈傷組織增殖的影響均達到顯著性水平，從3者的F值大小可以看出，影響迷迭香愈傷組織增殖的主次因素為：6-BA>NAA>6-BA×NAA。

2.2 對細胞形態(tài)的影響

不同植物激素處理下的愈傷組織細胞形態(tài)如圖3所示。其中，處理2、5、6、7、8的細胞形態(tài)大小與處理1基本相似，圖片省略。從圖3可看出，在LED白光下培養(yǎng)20 d后，處理1（對照）的愈傷組織細胞大小不一，形態(tài)各異，小部分細胞分裂旺盛，大部分細胞分化畸形；處理3的細胞均一性較好，細胞分化較少；處理4的細胞大小相對其他處理的較小，并且細胞分化較多；處理9有部分細胞相對較大。

3 結(jié)論與討論

3.1 6-BA不利于迷迭香愈傷組織的增殖

試驗結(jié)果表明，單獨添加0.5 mg/L NAA最適于迷迭香愈傷組織增殖，6-BA可導(dǎo)致迷迭香愈傷組織褐化。單獨加6-BA時，濃度越高，愈傷組織水潤褐化越嚴重，進而抑制迷迭香愈傷組織增殖生長。6-BA與NAA二者對愈傷組織的增殖影響是相互的，當(dāng)6-BA與NAA濃度比為1∶1時，愈傷組織的增殖系數(shù)最差，水潤褐化嚴重。說明6-BA與NAA的相互作用對迷迭香愈傷組織的褐化情況有顯著性影響。潭文澄等[9]研究表明，6-BA能刺激多酚氧化酶的活性，促進酚類物質(zhì)合成，加速愈傷組織褐化，NAA可延緩多酚合成，減輕褐化。

在該試驗中，與空白對照相比，在含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中單獨添加0.5 mg/L NAA

時愈傷組織增殖系數(shù)最大，為10.98；單獨添加1.0 mg/L NAA時愈傷組織增殖系數(shù)減小，為6.48，說明適宜濃度NAA能有效促進愈傷組織增殖生長，濃度過高或過低均不利于愈傷組織增殖。有研究表明，6-BA與NAA的濃度配比影響植物組織的形態(tài)發(fā)生及細胞分化[7]；NAA能影響多酚氧化酶的活性，抑制多酚的合成，促進愈傷組織細胞增殖生長，即說明6-BA促進多酚的合成，NAA抑制多酚的合成[8]。

圖1 不同植物激素處理下迷迭香愈傷組織的外觀形態(tài)

圖2 不同植物激素處理下迷迭香愈傷組織增殖系數(shù)

表2 不同植物激素處理迷迭香愈傷組織主體間效應(yīng)檢驗

3.2 6-BA與NAA配比影響迷迭香愈傷組織細胞形態(tài)

6-BA與NAA的濃度配比影響植物組織的形態(tài)發(fā)生及細胞分化[7]，細胞分裂素只有在生長素存在的前提下才能促進細胞分裂。該試驗顯微觀察結(jié)果表明，細胞分裂素與生長素濃度配比為1∶1時，愈傷組織細胞普遍較小，細胞形態(tài)畸形多，生長不均，同時愈傷組織生長狀態(tài)水潤褐化較嚴重，增殖系數(shù)最??；當(dāng)細胞分裂素與生長素濃度配比為2∶1時，愈傷組織細胞普遍較大，畸變形態(tài)細胞數(shù)量較多，細胞均一

性較差，增殖系數(shù)也較小；單獨添加生長素或細胞分裂素時，愈傷組織細胞形態(tài)也是大小不均，但畸形細胞數(shù)量相對較少，其中，單獨添加1.0 mg/L NAA時愈傷組織細胞均一性最好，畸變形態(tài)細胞數(shù)量最少，單獨添加0.5 mg/L NAA時愈傷組織細胞形態(tài)也較均勻?？梢姡鹩鷤M織增殖系數(shù)與細胞形態(tài)變化的最佳激素濃度配比略有差異，造成該現(xiàn)象的原因可能是由于NAA能加速細胞伸長生長，1個周期內(nèi)愈傷組織生長過快導(dǎo)致細胞大小分化不均勻。

圖3 不同植物激素處理下迷迭香愈傷組織的細胞形態(tài)

[1]劉明家.迷迭香組織培養(yǎng)及體內(nèi)迷迭香酸和鼠尾草酸含量測定[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2012.

[2]姚鳳琴.羅勒等4種唇形科香花植物離體培養(yǎng)與離體保存研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[3]于巧芝，劉芳，殷帆，等.不同光質(zhì)對迷迭香愈傷組織生長的影響[J].園藝與種苗，2013（3）：36-39.

[4]鞠倩.生長調(diào)節(jié)劑及蔗糖濃度對彩葉草組織培養(yǎng)物迷迭香酸含量的影響[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[5]白玉，高月，趙倩，等.紫茉莉愈傷組織誘導(dǎo)的激素優(yōu)化研究[J].園藝與種苗，2012（7）：52-54.

[6]呂曉玲，孫晶磊，王芳，等.外源激素對紫蘇愈傷組織誘導(dǎo)及迷迭香酸積累的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2012（6）：575-579.

[7]王慧英.影響植物愈傷組織形成的因素研究[J].聊城大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010（2）：51-53.

[8]方強，喬勇進，王海宏.不同植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源對黃芩細胞生長及次生代謝產(chǎn)物的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2008（1）：33-37.

[9]潭文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國林業(yè)出版社，2001.

（責(zé)任編輯 金蘋）

Effects of the Different Concentration Combinations of 6-BA and NAA on the Callus Growth in Rosmarinus officinalis L.

XU Xiao-pinget al.(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University, Fujian,Fuzhou 350002)

In this experiment,the callus of Rosmarinus officinalis was L.used as the material,and the two factors of three levels completely randomized trial was applied to study the effects of different concentration combinations of 6-BA and NAA on the callus growth on the basal MS solid medium containing 1.0 mg/L 2,4-D. The results showed that the best combination for the callus proliferation was 0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,and the proliferation coefficient was 10.98 after a day subculture cycle of 20 days.

Rosmarinus officinalis L.;Callus;BA;NAA;Proliferation

S573

A

2095-0896（2015）05-046-04

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（111ZC1401）；福建農(nóng)林大學(xué)高水平大學(xué)建設(shè)項目（閩農(nóng)林大規(guī)劃【2014】12號）。

徐小萍（1993-），女，福建浦城人，本科生，專業(yè)：園藝。*通訊作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源研究，E-mail：Laizx01@163.com。

2015-04-28