子宮切除術(shù)宮頸去留對陰道微生態(tài)的影響

姚 祺，黃美霞，閔羨蕙，李一妹

陰道內(nèi)的正常微生物菌群具有一定的抗原性，可激活機體的特異性及非特異性免疫系統(tǒng)以抵擋外界微生物侵襲［1］，T細(xì)胞17(Th17)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的不同于Th1、Th2的CD4+T細(xì)胞亞群，是招募中性粒細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)者。因此我們設(shè)想:子宮切除術(shù)對患者陰道微生態(tài)環(huán)境的影響是否與Th17變化有關(guān)?為了證實這一設(shè)想，我們觀察了200例不同子宮切除術(shù)和100例非子宮切除術(shù)患者，以期為恢復(fù)陰道微生態(tài)環(huán)境提供意見，報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 2011年1月－2014年9月300例因子宮良性疾病接受子宮手術(shù)患者納入研究，其中，子宮肌瘤234例，子宮腺肌瘤50例，功能失調(diào)性子宮出血16例。根據(jù)手術(shù)方式分為全子宮切除組(100例)、次全子宮切除組(100例)及非子宮切除組(100例)。所有患者均獲得隨訪。300例術(shù)前均陰道分泌物微生態(tài)評估顯示正常，年齡40～55(43.2±5.6)歲。本研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。三組患者在年齡、病程、病種等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05)，具有均衡性和可比性。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)［2］①有自身免疫性疾病并發(fā)癥者;②嚴(yán)重肝臟、腎臟、或心功能異常者;③有影響陰道微生態(tài)的行為;④合并惡性腫瘤及重癥感染者。

1.3 主要試劑和儀器 厭氧發(fā)生器、厭氧袋、哥侖比亞、沙保羅、RS、ANA培養(yǎng)基(英國OXOID公司)。Rapid ID32A、PI Coryne APINH、API 50CHL 及其他細(xì)菌鑒定條購于梅里埃公司。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、H2O2酶購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。H2O2鑒定培養(yǎng)基制作:MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入0.25 mg/mL TMB和0.01 mg/ml辣根過氧化物酶(HRP)。

1.4 檢查方法

1.4.1 陰道微生態(tài)檢測方法 用無菌刮板刮取陰道側(cè)壁上1/3處分泌物，用無菌長棉簽將分泌物分裝于兩根無菌管內(nèi)，對其中一無菌管內(nèi)加入0.5 mL的生理鹽水混勻，制作一份涂片后在光鏡下(400倍)觀察優(yōu)勢病菌以及滴蟲的數(shù)量及比例。再制作一份涂片進行革蘭(Gram)染色法染色，將固定后結(jié)晶紫液中染色45 s，用0.01MPBS沖洗干凈，再用革蘭碘60 s，在碘丙酮中分化直至涂片無色透明，再用0.01MPBS沖洗干凈后于1%中性紅染核60 s，再用0.01MPBS沖洗干凈后置于顯微鏡下檢測陰道微生態(tài)。另一無菌管使用pH3.8～5.4精密試紙測定陰道分泌物pH后用于檢查陰道微生物功能(唾液酸苷酶、白細(xì)胞酯酶、H2O2)，所有操作均按照說明書進行。

1.4.2 陰道微生態(tài)檢測內(nèi)容

1.4.2.1 陰道微生態(tài)衡量標(biāo)準(zhǔn)［3-4］①陰道菌群的密集度為Ⅱ～Ⅲ級，陰道菌群多樣性為Ⅱ～Ⅲ級，優(yōu)勢病菌為乳酸桿菌(乳酸桿菌功能正常即H2O2陽性)，清潔度為1度，pH＜4.5;②陰道菌群的密集度、多樣性、優(yōu)勢病菌種類、清潔度及pH值中的一項出現(xiàn)異常均視為陰道微生態(tài)失調(diào)。

1.4.2.2 革蘭染色后顯微鏡檢測 ①菌群密集度:將油鏡下每視野平均細(xì)菌數(shù)分為Ⅰ～Ⅳ級，具體分級內(nèi)容:Ⅰ級:1～10個細(xì)菌;Ⅱ級:11～100個細(xì)菌;Ⅲ級:101～1000個細(xì)菌;Ⅳ級:1001個細(xì)菌以上;②菌群多樣性:根據(jù)油鏡下每視野可被辨識的細(xì)菌菌群數(shù)作為分級的標(biāo)準(zhǔn)，具體如下:Ⅰ級:1～3種細(xì)菌;Ⅱ級:4～6種細(xì)菌;Ⅲ級:7～9種細(xì)菌;Ⅳ級:10種細(xì)菌以上;③優(yōu)勢菌:陰道分泌物標(biāo)本中分布最多的病菌;④病原微生物:主要是真菌菌絲和(或)滴蟲;⑤采用Nugent評分法對革蘭染色圖片進行評分，將評分≥7的涂片定義為BV(+);⑥陰道微生態(tài)功能測定:采用鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)的陰道炎五聯(lián)檢測試劑盒分別檢測過H2O2、唾液酸苷酶和白細(xì)胞脂酶3項功能。

1.4.2.3 Nugent評分法 取新鮮陰道分泌物進行革蘭染色涂片，由微生物室在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并進行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為:0～3分為正常，4～6分為臨界范圍，7～10分為細(xì)菌性陰道病。

1.5 Th17細(xì)胞濃度檢測 采集不同組別陰道分泌物1 mL，加入100 μL 10%多聚甲醛固定液進行固定，靜置20 s后將上層懸濁液吸取至測定管內(nèi)，加入CD3-FITC、CD4-PE和CD8-APC抗體，室溫避光孵育20 min，洗滌2次，用1%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 17.0和 GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)比較先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。若兩者相符，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進行多樣本均數(shù)間的兩兩比較。若有一項不符，則采用Kruskal-Wallis H檢驗和Dunn＇s多重檢驗對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰道菌群密度和菌辟多樣性檢出情況 表1、表2提示，三組患者選擇不同手術(shù)方式后，患者陰道微生態(tài)陰道菌群密集度及多樣性變化存在顯著差異(P ＜0.05)。

表1 三組患者陰道菌群密集度情況比較［n(%)］

表2 三組患者菌群多樣性情況比較［n(%)］

2.2 優(yōu)勢菌檢出情況分析 表3提示，三組乳酸桿菌比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 三組患者優(yōu)勢菌情況比較［n(%)］

2.3 病原菌檢出情況 表4顯示，關(guān)于病原菌感染情況，兩組子宮切除術(shù)無明顯差異，但與非子宮切除術(shù)組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 兩組患者病原菌情況比較［n(%)］

2.4 Nugent評分情況 表5表明，三組Nugent評分存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 陰道pH值情況 三組陰道pH值比例分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表6。

2.6 陰道微生態(tài)功能比較 陰道微生態(tài)功能三組結(jié)果統(tǒng)計差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表7。

2.7 陰道分泌物Th17細(xì)胞百分率比較 非子宮切除組CD4+IL-17+T細(xì)胞百分率(0.71±0.18)% 次全子宮切除組CD4+IL-17+T細(xì)胞百分率(0.93±0.22)%，均顯著低于全子宮切除組的(2.58±0.48)%，三組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表5 三組患者Nugent評分［n(%)］

表6 三組患者pH值檢出情況［n(%)］

表7 三組患者陰道微生物功能情況［n(%)］

3 討論

近年來不斷有臨床數(shù)據(jù)［5-7］推翻次全子宮切除術(shù)存留子宮頸可增加宮頸殘端癌這一說法，在巴氏涂片篩查及陰道鏡技術(shù)不斷推廣下，殘留宮頸可能導(dǎo)致脫垂、溢液等問題被一一否定，人們重拾對子宮切除宮頸去留利弊的探討。

3.1 不同手術(shù)方式對陰道微生態(tài)的影響 隨著陰道微生態(tài)觀念日益深入，從整體觀、平衡觀評價術(shù)后陰道微生態(tài)的變化逐漸被人們所接受，因此我們認(rèn)為從陰道微生態(tài)環(huán)境的角度評估不同手術(shù)方式的臨床效果有較大可行性［8-10］。常規(guī)情況下陰道菌群分為常住菌、過路菌及偶見菌三種類別，其中乳酸桿菌是陰道菌群中的優(yōu)勢病菌，其可制約、協(xié)調(diào)不同菌群之間的生長，以維持陰道微生態(tài)的動態(tài)平衡。本研究結(jié)果顯示三組患者陰道微生態(tài)系統(tǒng)均產(chǎn)生不良變化，但不同組別患者陰道菌群仍均以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群，其中非子宮切除術(shù)組患者乳酸桿菌的比例最大，次全子宮切除術(shù)組次之，這一結(jié)果提示保留子宮或子宮頸后陰道具有更多數(shù)量的乳酸桿菌，而乳酸桿菌調(diào)節(jié)免疫功能的作用已被廣泛認(rèn)可，其對病原菌的生長具有更明顯的抑制作用，可通過更強烈的競爭黏附病原菌達到維持陰道微生態(tài)菌群平衡的目的。另外產(chǎn)生這一結(jié)果還可能與子宮次全切除術(shù)保留宮頸管內(nèi)部分內(nèi)膜有關(guān)，宮頸管內(nèi)膜由腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞組成，可應(yīng)激性代償一部分子宮內(nèi)分泌功能［11-13］。研究中我們得知子宮全切術(shù)對患者陰道pH值影響明顯較大，我們認(rèn)為這主要是由于子宮全切術(shù)后宮頸黏液快速減少甚至消失，宮頸黏液屬于宮頸內(nèi)堿性分泌物，具有調(diào)和陰道pH的作用，隨著宮頸黏液減少陰道pH逐漸降低，非子宮切除術(shù)及次全子宮切除術(shù)由于保留了子宮頸，因此對陰道pH影響減小。

3.2 不同手術(shù)方式對陰道分泌物的Th17細(xì)胞百分比的影響 本課題對三組患者陰道分泌物的Th17細(xì)胞濃度進行檢測，發(fā)現(xiàn)非子宮切除術(shù)組CD4+IL-17+T細(xì)胞百分率顯著低于兩組子宮切除術(shù)患者，而其中次全子宮切除組亦低于全子宮切除組。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)與Th1及Th2性質(zhì)不同的CD4+T細(xì)胞亞群，它在機體自身免疫及炎癥調(diào)控環(huán)節(jié)充當(dāng)主要調(diào)節(jié)者的角色，目前我們可知，子宮切除術(shù)后患者發(fā)生陰道慢性炎癥的風(fēng)險系數(shù)明顯增高，白介素家族尤其是IL-6在炎性微環(huán)境中被趨化聚集，此時幼稚的CD4+T在IL-6的作用下分化為Th17細(xì)胞，同時分泌 IL-17(主要是指 IL-17A)，IL-17自1995年被首次發(fā)現(xiàn)以來，一直被認(rèn)為是源自T淋巴細(xì)胞的促炎因子，當(dāng)IL-17與相應(yīng)受體結(jié)合后作用于機體多種類型細(xì)胞，誘導(dǎo)多種促炎因子分泌，如TNF-α、GM-CSF、IL-23，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程，因此我們認(rèn)為Th17細(xì)胞分化和免疫功能的調(diào)控研究具有重要的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用價值。有文獻認(rèn)為子宮切除術(shù)后患者陰道免疫防御系統(tǒng)發(fā)生變化，我們進行相同指標(biāo)檢測時發(fā)現(xiàn)子宮全切術(shù)患者術(shù)后Th17細(xì)胞百分率明顯高于次全子宮切除術(shù)患者，說明宮頸的保留對陰道免疫因子的影響小。

通過本研究我們有理由相信宮頸去留與否確實對陰道微生態(tài)具有不同影響，子宮頸的保留對陰道的菌群、pH值及免疫防御影響小，更有利于促進陰道微生態(tài)平衡的維持。在倫理學(xué)的指導(dǎo)下，本研究僅憑患者已接受的手術(shù)方式作為分組的標(biāo)準(zhǔn)，并未進行隨機分組，結(jié)果可能在一定程度上存在偏倚，另一方面可能此次入選樣本量較小、隨訪時間較短有關(guān)，故有待于增加樣本量，進一步擴大研究予以探討子宮切除術(shù)中宮頸去留的利弊。但無論如何隨著社會發(fā)展、人們物質(zhì)生活的提高、婦女壽命的延長和激素替代治療的開展，人們對生活質(zhì)量有了新的認(rèn)識和要求，因此應(yīng)提倡對每一例確需行子宮切除者，均應(yīng)全面權(quán)衡并向患者說明宮頸去留的利弊，并由患者與醫(yī)生共同決定術(shù)式，以提高患者對手術(shù)的滿意度和術(shù)后生活質(zhì)量。

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