• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    過(guò)敏毒素C3a在腎小球足細(xì)胞中的分泌性表達(dá)試驗(yàn)

    2015-12-08 03:32:18鄭敬民趙文緊
    東南國(guó)防醫(yī)藥 2015年3期
    關(guān)鍵詞:補(bǔ)體細(xì)胞株培養(yǎng)液

    鄭敬民,尹 廣,趙文緊

    作為先天性免疫的一個(gè)重要組成部分,補(bǔ)體系統(tǒng)在機(jī)體免疫防御中起著極為重要的作用[1-3]。但補(bǔ)體系統(tǒng)的不適當(dāng)激活也會(huì)導(dǎo)致組織的損傷,成為引發(fā)人類(lèi)疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素[4-7]。在腎臟,補(bǔ)體活化與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種病變相關(guān)[8-11],但有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)參與糖尿病腎病等腎組織損傷的機(jī)制仍未明了。長(zhǎng)期以來(lái),人們對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)功能了解更多的是基于膜攻擊復(fù)合物對(duì)病菌和病變細(xì)胞裂解的效應(yīng),在各種途徑的補(bǔ)體活化過(guò)程中,還產(chǎn)生了一系列被稱(chēng)作過(guò)敏毒素的補(bǔ)體成分小片段(包括 C3a、C4a和 C5a,分別由 C3、C4 和 C5裂解產(chǎn)生),它們也可能參與糖尿病腎病等腎組織損傷過(guò)程。有研究顯示[12-13],包括腎小管上皮細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞在內(nèi)的腎組織上皮細(xì)胞均有表達(dá)過(guò)敏毒素C3a的受體C3aR,且在糖尿病腎病等特定病理?xiàng)l件下腎組織上皮細(xì)胞中C3aR的表達(dá)水平亦明顯增加,提示過(guò)敏毒素C3a可通過(guò)其受體參與糖尿病腎病等腎臟疾病的腎組織損傷過(guò)程,然而各種過(guò)敏毒素在腎組織損傷中的確切病理作用和意義仍不是很清楚。為了探討過(guò)敏毒素C3a在腎小球足細(xì)胞中的可能作用和病理意義,本文設(shè)計(jì)和建立了過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒體系,并將其導(dǎo)入人腎小球足細(xì)胞系中,建立了分泌性高表達(dá)過(guò)敏毒素C3a的人腎小球足細(xì)胞株,為深入探討C3a對(duì)腎小球足細(xì)胞的作用及機(jī)制提供了很好的細(xì)胞模型。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞和試劑來(lái)源 人足細(xì)胞系(human podocytes,HPC)從美國(guó) ATCC購(gòu)得;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒試劑、胎牛血清和1640培養(yǎng)基從Gibco公司購(gòu)得;殺稻瘟菌素、凝聚胺(Polybrene)和TRIZOL為 invitrogen公司產(chǎn)品;“PrimeScript RT Master Mix”逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和“SYBR Premix Ex Taq II”熒光定量PCR試劑盒為T(mén)arkara產(chǎn)品;293 T細(xì)胞、慢病毒空載體和包裝質(zhì)粒均由Invitrogen公司提供;人C3a ELISA試劑盒購(gòu)自BD公司。

    1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分泌性高表達(dá)過(guò)敏毒素C3a細(xì)胞株的構(gòu)建方法

    1.2.1 HPC的培養(yǎng) HPC采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng),其中含1%ITS和10%胎牛血清,HPC細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為33℃(于含CO25%的孵箱中)。

    1.2.2 基因轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選 將HPC細(xì)胞以2×105/mL接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔接種0.5 mL);33℃培養(yǎng)24 h后,按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)等于10的比例吸取適量過(guò)敏毒素C3a表達(dá)重組慢病毒,以培養(yǎng)液稀釋病毒液(最后稀釋致 100 μL/孔的量),同時(shí)加入 8 μg/mL(終濃度)的Polybrene,吹打混勻后將其加入至吸去培養(yǎng)液的24孔板細(xì)胞上;繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,吸去含病毒的培養(yǎng)液,換上新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);48 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否發(fā)出綠色熒光(成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可發(fā)出綠色熒光,據(jù)此判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功);消化細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔板中,加入殺稻瘟菌素(終濃度為10 g/mL)進(jìn)行藥物篩選,每3 d換一次培養(yǎng)液,2周后,即得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的足細(xì)胞。

    1.2.3 建立單克隆細(xì)胞株 通過(guò)連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)構(gòu)建單克隆細(xì)胞株。即先利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)欲建立單細(xì)胞克隆的細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù),再利用培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂屩撩亢辽囵B(yǎng)液約含5個(gè)細(xì)胞時(shí),將稀釋液以每孔50 μL、100 μL的量接種到96孔板中。置33℃孵箱培養(yǎng)14 d后,相差顯微鏡下觀察找出單克隆細(xì)胞團(tuán),經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),獲得單克隆細(xì)胞株。

    1.3 C3a分泌水平分析 以2×105個(gè)細(xì)胞/孔分別將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a的單克隆細(xì)胞株和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照足細(xì)胞株接種于24孔板(每種細(xì)胞各3孔),待細(xì)胞貼壁(約6 h)后,將培養(yǎng)液換成無(wú)血清的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)2 d后,吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清,10 000×g離心5 min后,取上清利用人C3a ELISA試劑盒分析培養(yǎng)上清中C3a水平。

    1.4 C3a mRNA表達(dá)水平的分析 采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行,具體如下:利用TRIZOL試劑提取細(xì)胞RNA;利用“PrimeScript RT Master Mix”試劑盒合成cDNA;采用“SYBR Premix Ex Taq II”試劑盒于ABI公司的7900型實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程以18S RNA作為內(nèi)參。PCR過(guò)程為:95℃下預(yù)變性1 min,然后進(jìn)行DNA變溫?cái)U(kuò)增過(guò)程(95℃ 15 s,60℃ 30s,如此40個(gè)循環(huán))。所用引物由金唯智公司合成,其序列為:人18S RNA sense:5’-ttt ctc gat tcc gtg ggt gg-3’;人18S RNA antisense:5’-agc atg cca gag tct cgt tc-3’;人 C3a sense:5’-aag tcg gca agt acc cca ag-3’;人 C3a antisense:5’-agt tgc agc agt cca gga ag-3’。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。定量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 過(guò)敏毒素C3a分泌型慢病毒表達(dá)體系的構(gòu)建結(jié)果 通過(guò)先構(gòu)建過(guò)敏毒素C3a分泌型表達(dá)慢病毒載體、再在293 T細(xì)胞中包裝成重組慢病毒,最后得到滴度約為5×108/mL的過(guò)敏毒素C3a分泌型表達(dá)重組慢病毒溶液。圖1所示的是本文設(shè)計(jì)的過(guò)敏毒素C3a分泌型表達(dá)慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖[重組C3a基因由5’端的IL-6基因的信號(hào)肽序列和下游C3a編碼序列組成,整個(gè)基因的表達(dá)由CMV啟動(dòng)子控制;此外,載體上有一綠色熒光蛋白基因(EGFP)和殺稻瘟菌素分解酶基因(Blasticidin)];圖2所示的是其部分測(cè)序結(jié)果,顯示所構(gòu)建載體的序列完全正確。

    2.2 過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞細(xì)胞株的構(gòu)建結(jié)果 以過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒轉(zhuǎn)染HPC細(xì)胞48 h后,熒光顯微鏡下可見(jiàn)幾乎所有細(xì)胞均可發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光,說(shuō)明病毒轉(zhuǎn)染效率很高,轉(zhuǎn)染很成功。經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)液中加殺稻瘟菌素篩選,獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒的細(xì)胞群,其中的每個(gè)細(xì)胞均可發(fā)出明亮的綠色熒光(圖3,其中d是c同一視野下的相差顯微鏡照片)。再通過(guò)連續(xù)梯度稀釋法篩選,構(gòu)建成了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a的重組細(xì)胞克隆(圖3中e,可見(jiàn)所有細(xì)胞發(fā)出了均勻的綠色熒光),經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏素素C3a重組慢病毒的細(xì)胞株HPC-C3a。

    圖1 過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖

    圖2 過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒載體的部分測(cè)序結(jié)果(示過(guò)敏毒素C3a基因3’端插入點(diǎn)周?chē)臏y(cè)序結(jié)果)

    圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)敏毒素C3a的細(xì)胞株(HPC-C3a細(xì)胞株)的構(gòu)建結(jié)果

    2.3 HPC-C3a細(xì)胞株中C3a表達(dá)和分泌水平分析結(jié)果 PCR分析顯示:與作為對(duì)照的正常(非轉(zhuǎn)染)HPC細(xì)胞相比,HPC-C3a細(xì)胞株中C3a mRNA表達(dá)水平顯著升高[正常對(duì)照C3a mRNA相對(duì)水平為(1.0 ±0.6),HPC-C3a細(xì)胞株 C3a mRNA 相對(duì)水平為(771.0±172.0)]。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中過(guò)敏毒素C3a水平的檢測(cè)顯示:與作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)染HPC細(xì)胞相比,HPC-C3a細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的C3a水平增加了 600 多倍[(201.0 ±21.0)ng/mL vs(0.3 ±0.1)ng/mL]。

    3 討論

    近年來(lái),有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)的不當(dāng)激活在人類(lèi)疾病中的作用引起了越來(lái)越多研究者的關(guān)注,成為了人類(lèi)疾病機(jī)制研究的一個(gè)新熱點(diǎn)[1-4]。雖然人們?cè)缇驼J(rèn)識(shí)到包括糖尿病腎病、膜性腎病和狼瘡性腎炎在內(nèi)的多種腎臟疾病患者腎組織中均存在補(bǔ)體過(guò)度活化現(xiàn)象,但對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)在腎組織損傷中的確切作用和參與腎組織損傷的確切分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)卻仍然很有限。

    理論上,補(bǔ)體的過(guò)度活化可以多種方法參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。其中膜攻擊復(fù)合物長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所關(guān)注。但在補(bǔ)體的鏈?zhǔn)郊せ钸^(guò)程中,同時(shí)產(chǎn)生了包括過(guò)敏毒素C3a在內(nèi)的一系列小片段分子,它們被釋放到周?chē)h(huán)境中,參與了對(duì)機(jī)體細(xì)胞功能的各種調(diào)節(jié)。作為一種重要的炎癥因子,過(guò)敏毒素C3a可通過(guò)與其受體C3aR的相互作用趨化和激活白細(xì)胞[14-17]。近年的研究顯示[11],除了廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞外,過(guò)敏毒素C3a的受體C3aR還表達(dá)于包括腦、肝、肺、腎臟在內(nèi)的多種器官中的組織細(xì)胞中,且在不同的生理和病理情景中顯示出了多種重要功能。在腎臟,C3aR主要表達(dá)于上皮細(xì)胞(包括腎小管上皮細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞)[12-13],但目前對(duì)于腎組織細(xì)胞中C3aR的生理功能和各種病理情景下的病理意義仍不清楚??紤]到多種腎病患者腎組織中存在的補(bǔ)體過(guò)度活化現(xiàn)象(即有大量的過(guò)敏素素C3a會(huì)被釋放出來(lái)并可能激活其腎組織細(xì)胞中的受體C3aR)、C3a信號(hào)傳導(dǎo)在一些組織細(xì)胞中所表現(xiàn)出來(lái)的包括影響細(xì)胞發(fā)育分化、細(xì)胞增殖或凋亡等在內(nèi)的重要功能[18-22]以及腎小球足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病等腎臟疾病中的重要性,我們推測(cè):在糖尿病腎病等病理情況下,腎組織補(bǔ)體過(guò)度活化產(chǎn)生的過(guò)敏素素C3a很可能通過(guò)激活其位于足細(xì)胞上的受體參與足細(xì)胞損傷過(guò)程,從而在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。為了探討過(guò)敏毒素C3a在腎小球足細(xì)胞損傷中的可能病理作用和分子機(jī)制,本文進(jìn)行了分泌性過(guò)表達(dá)過(guò)敏毒素C3a人腎小球足細(xì)胞株的構(gòu)建。我們首先設(shè)計(jì)合成了過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)單元,并成功地將其克隆到了慢病毒表達(dá)載體上,經(jīng)全序列測(cè)序驗(yàn)證,得到序列完全正確的過(guò)敏毒素C3a分泌性慢病毒表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上,筆者利用293 T細(xì)胞進(jìn)行了重組慢病毒的包裝,并得到了高滴度的過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒。利用過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒轉(zhuǎn)染HPC細(xì)胞48 h后,筆者在熒光顯微鏡下觀察到了大量的能發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可分為兩類(lèi):基因組中插入重組慢病毒DNA的細(xì)胞和基因組中未插入重組慢病毒DNA的細(xì)胞(重組DNA在細(xì)胞基因組外游離存在)。其中,只有基因組中插入重組慢病毒DNA的細(xì)胞可長(zhǎng)期穩(wěn)定地傳遞和表達(dá)轉(zhuǎn)基因(包括過(guò)敏毒素C3a基因、綠色熒光蛋白基因和殺稻瘟菌素分解酶基因),故稱(chēng)為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。而重組DNA游離在細(xì)胞基因組外的轉(zhuǎn)染細(xì)胞卻不能將轉(zhuǎn)基因(包括過(guò)敏毒素C3a基因、綠色熒光蛋白和殺稻瘟菌素分解酶基因)穩(wěn)定地傳遞到下一代細(xì)胞,其轉(zhuǎn)基因的表達(dá)具有瞬時(shí)性,故稱(chēng)為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)這一原理,本文利用在培養(yǎng)液中長(zhǎng)期加殺稻瘟菌素的辦法來(lái)除去瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞群。在此基礎(chǔ)上,本文又利用連續(xù)梯度稀釋克隆法進(jìn)行了細(xì)胞的克隆化篩選培養(yǎng),最終得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)重組慢病毒的足細(xì)胞株HPCC3a。利用PCR和ELISA方法,本文對(duì)HPC-C3a細(xì)胞株過(guò)敏毒素C3a的表達(dá)和分泌情況進(jìn)行了分析,結(jié)果證實(shí)了過(guò)敏毒素C3a在HPC-C3a細(xì)胞株中的分泌性高水平表達(dá),說(shuō)明成功構(gòu)建了分泌性過(guò)表達(dá)過(guò)敏毒素C3a的人腎小球足細(xì)胞株。上述工作不僅為進(jìn)一步研究各種病理情況下過(guò)敏毒素C3a在人腎小球足細(xì)胞損傷中的作用和意義,探討補(bǔ)體活化產(chǎn)生的過(guò)敏毒素C3a致腎小球足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制提供了很好的細(xì)胞模型,所建立的過(guò)敏毒素C3a分泌性表達(dá)慢病毒體系也為進(jìn)一步開(kāi)展C3a對(duì)其他細(xì)胞的作用和病理意義創(chuàng)造了條件。

    [1] Lappegard KT,Garred P,Jonasson L,et al.A vital role for complement in heart disease[J].Mol Immunol,2014,61(2):126-134.

    [2] Schramm EC,Clark SJ,Triebwasser MP,et al.Genetic variants in the complement system predisposing to age-related macular degeneration:a review[J].Mol Immunol,2014,61(2):118-125.

    [3] Peterson SL,Anderson AJ.Complement and spinal cord injury:traditional and non-traditional aspects of complement cascade function in the injured spinal cord microenvironment[J].Exp Neurol,2014,258:35-47.

    [4] Hertle E,Stehouwer CD,van Greevenbroek MM.The complement system in human cardiometabolic disease[J].Mol Immunol,2014,61(2):135-148.

    [5] 甘燕玲,楊至宜,孫朝暉,等.快速CRP檢測(cè)對(duì)兒童上呼吸道感染的鑒別診斷價(jià)值[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2011,25(3):264-265.

    [6] 陳金弟,王智華,李華良,等.抗腦抗體對(duì)精神分裂癥自身免疫反應(yīng)的探討[J].東南國(guó)防醫(yī)藥,2004,6(3):171-172.

    [7] 任紅旗,吳梅月,蔡 青,等.腎淀粉樣變性10例臨床病理分析[J].東南國(guó)防醫(yī)藥,2011,13(4):348-349.

    [8] Fearn A,Sheerin NS.Complement activation in progressive renal disease[J].World J Nephrol,2015,4(1):31-40.

    [9] Thurman JM1.Complement in kidney disease:core curriculum 2015[J].Am J Kidney Dis,2015,65(1):156-168.

    [10]鄭敬民,尹 廣,姚根宏,等.腎病患者腎組織補(bǔ)體活化與肥大細(xì)胞滑潤(rùn)的關(guān)系研究[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2012,25(10):1040-1044.

    [11] Klos A,Wende E,Wareham KJ,et al.International Union of Basic and Clinical Pharmacology[corrected].LXXXVII.Complement peptide C5a,C4a,and C3a receptors[J].Pharmacol Rev,2013,65(1):500-543.

    [12] Braun MC,Reins RY,Li TB,et al.Renal expression of the C3a receptor and functional responses of primary human proximal tubular epithelial cells[J].J Immunol,2004,173(6):4190-4196.

    [13]鄭敬民,朱小東,張明超,等.過(guò)敏毒素受體(C3aR)在db/db糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達(dá)及病理意義分析[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2010,37(8):847-845.

    [14] Mueller-Ortiz SL,Morales JE,Wetsel RA.The receptor for the complement C3a anaphylatoxin(C3aR)provides host protection against listeria monocytogenes-induced apoptosis[J].J Immunol,2014,193(3):1278-1289.

    [15] Niebuhr M,Bumer W,Kietzmann M,et al.Participation of complement 3a receptor(C3aR)in the sensitization phase of Th2 mediated allergic contact dermatitis[J].Exp Dermatol,2012,21(1):52-56.

    [16] Bao L,Wang Y,Haas M,et al.Distinct roles for C3a and C5a in complement-induced tubulointerstitial injury[J].Kidney Int,2011,80(5):524-534.

    [17] Zhou W.The new face of anaphylatoxins in immune regulation[J].Immunobiology,2012,217(2):225-234.

    [18] Carmona-Fontaine C,Theveneau E,Tzekou A,et al.Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration[J].Dev Cell,2011,21(6):1026-1037.

    [19] Yu M,Zou W,Peachey NS,et al.A novel role of complement in retinal degeneration[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(12):7684-7692.

    [20] Tu Z,Bu H,Dennis JE,et al.Efficient osteoclast differentiation requires local complement activation[J].Blood,2010,116(22):4456-4463.

    [21] Lim J,Iyer A,Suen JY,et al.C5aR and C3aR antagonists each inhibit diet-induced obesity,metabolic dysfunction,and adipocyte and macrophage signaling[J].FASEB J,2013,27(2):822-831.

    [22] Xu XH,Peng HS,Sun MQ,et al.C-terminal peptide of anaphylatoxin C3a enhances hepatic function after steatotic liver transplantation:a study in a rat model[J].Transplant Proc,2010,42(3):737-740.

    猜你喜歡
    補(bǔ)體細(xì)胞株培養(yǎng)液
    “補(bǔ)體法”在立體幾何解題中的妙用
    從一道試題再說(shuō)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用
    補(bǔ)體因子H與心血管疾病的研究進(jìn)展
    抗dsDNA抗體、補(bǔ)體C3及其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)于診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損傷的臨床意義
    調(diào)整蔗糖、硼酸和pH值可優(yōu)化甜櫻桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)液
    不同培養(yǎng)液對(duì)大草履蟲(chóng)生長(zhǎng)與形態(tài)的影響研究
    流感患兒血清免疫球蛋白及補(bǔ)體的檢測(cè)意義
    超級(jí)培養(yǎng)液
    穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    美女中出高潮动态图| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲 国产 在线| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩av久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品免费大片| 精品久久久久久电影网| 大香蕉久久成人网| 一二三四社区在线视频社区8| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 99国产精品一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 看免费av毛片| 一级毛片电影观看| 午夜激情久久久久久久| 大香蕉久久成人网| 国产精品 国内视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成年人免费黄色播放视频| 国产成人系列免费观看| 无遮挡黄片免费观看| 成人av一区二区三区在线看 | 少妇粗大呻吟视频| 国产av国产精品国产| 精品第一国产精品| svipshipincom国产片| 成人三级做爰电影| 色婷婷av一区二区三区视频| 少妇人妻久久综合中文| 午夜老司机福利片| 后天国语完整版免费观看| 十八禁人妻一区二区| 免费观看av网站的网址| 成人免费观看视频高清| 91精品三级在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩精品免费视频一区二区三区| www.自偷自拍.com| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产视频一区二区在线看| 水蜜桃什么品种好| 老司机亚洲免费影院| 人妻人人澡人人爽人人| 精品久久久精品久久久| 9191精品国产免费久久| 色播在线永久视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品亚洲成国产av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 老司机靠b影院| 婷婷色av中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 妹子高潮喷水视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 午夜福利视频精品| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产亚洲欧美精品永久| 国产97色在线日韩免费| 69精品国产乱码久久久| 国产一区二区在线观看av| 亚洲国产av影院在线观看| 三级毛片av免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文字幕色久视频| 亚洲国产av新网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 丝袜人妻中文字幕| 成人黄色视频免费在线看| 后天国语完整版免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 又大又爽又粗| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产成人av教育| 亚洲人成电影免费在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产免费福利视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 久久免费观看电影| 久久性视频一级片| 久久九九热精品免费| 99精品久久久久人妻精品| 日本一区二区免费在线视频| 69精品国产乱码久久久| 亚洲伊人久久精品综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女主播在线视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一进一出抽搐动态| 热99re8久久精品国产| 亚洲国产av影院在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 91老司机精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 两个人看的免费小视频| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲 欧美一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 一区二区三区四区激情视频| 高清欧美精品videossex| 岛国在线观看网站| 少妇 在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲一区中文字幕在线| 一本综合久久免费| 一本久久精品| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 97精品久久久久久久久久精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人欧美| 丁香六月天网| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久久精品免费免费高清| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲男人天堂网一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 大香蕉久久网| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲黑人精品在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄片大片在线免费观看| 热99re8久久精品国产| 国产男人的电影天堂91| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久热在线av| 黑人操中国人逼视频| 国产精品1区2区在线观看. | 捣出白浆h1v1| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲精品自拍成人| 超色免费av| 久久香蕉激情| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色a级毛片大全视频| 午夜91福利影院| 成年人午夜在线观看视频| 日韩一区二区三区影片| 新久久久久国产一级毛片| 男人添女人高潮全过程视频| 深夜精品福利| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久久久久久久久大奶| 国产色视频综合| 男女之事视频高清在线观看| 大型av网站在线播放| 一级,二级,三级黄色视频| 十八禁人妻一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 高清黄色对白视频在线免费看| 女人久久www免费人成看片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲黑人精品在线| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美久久黑人一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲熟女毛片儿| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产亚洲欧美在线一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 桃红色精品国产亚洲av| 成人国语在线视频| 青青草视频在线视频观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | svipshipincom国产片| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲一区中文字幕在线| 三上悠亚av全集在线观看| www.av在线官网国产| 日韩欧美免费精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成人三级做爰电影| xxxhd国产人妻xxx| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美成人午夜精品| 91成人精品电影| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一个人免费在线观看的高清视频 | 国产精品成人在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男女国产视频网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 在线看a的网站| 久久精品成人免费网站| 免费在线观看黄色视频的| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品一二三区在线看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲男人天堂网一区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品乱久久久久久| 天堂8中文在线网| 丰满少妇做爰视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜免费成人在线视频| 岛国毛片在线播放| cao死你这个sao货| 在线av久久热| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲av电影在线进入| 女人久久www免费人成看片| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人国语在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 下体分泌物呈黄色| 亚洲少妇的诱惑av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av男天堂| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品久久久久久精品电影小说| 成年av动漫网址| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 中文字幕人妻丝袜制服| 99精品久久久久人妻精品| 搡老乐熟女国产| 精品国产国语对白av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲欧美精品自产自拍| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线精品无人区一区二区三| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲av男天堂| 国产免费视频播放在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 天天影视国产精品| 久久人妻熟女aⅴ| 午夜老司机福利片| 看免费av毛片| 国产精品一二三区在线看| 久久狼人影院| 黄色视频不卡| 久久精品亚洲av国产电影网| 多毛熟女@视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 捣出白浆h1v1| 久久九九热精品免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品高清国产在线一区| 婷婷成人精品国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产99久久九九免费精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 美女午夜性视频免费| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产高清国产精品国产三级| 少妇 在线观看| 另类亚洲欧美激情| 男女边摸边吃奶| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜福利视频在线观看免费| 90打野战视频偷拍视频| 人成视频在线观看免费观看| 各种免费的搞黄视频| 91九色精品人成在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美日韩av久久| 日韩电影二区| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日本五十路高清| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一区在线观看完整版| 欧美大码av| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 满18在线观看网站| www.精华液| 老司机靠b影院| 最近最新中文字幕大全免费视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99国产精品一区二区蜜桃av | 自线自在国产av| 免费高清在线观看日韩| av片东京热男人的天堂| 午夜91福利影院| 日本91视频免费播放| 精品免费久久久久久久清纯 | 嫩草影视91久久| 久久国产精品大桥未久av| 女人精品久久久久毛片| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品在线美女| 在线天堂中文资源库| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品国产国语对白av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 最新在线观看一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲性夜色夜夜综合| 女人精品久久久久毛片| 一本久久精品| 国产日韩欧美在线精品| 交换朋友夫妻互换小说| 国产高清videossex| 午夜激情av网站| 人妻一区二区av| 99精品久久久久人妻精品| 热re99久久国产66热| 丝袜喷水一区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 91麻豆av在线| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久欧美国产精品| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产又爽黄色视频| 中亚洲国语对白在线视频| 91老司机精品| 91字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 十八禁网站免费在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产成+人综合+亚洲专区| 成年动漫av网址| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄片播放在线免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日韩欧美免费精品| 午夜成年电影在线免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲免费av在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| av视频免费观看在线观看| 中文欧美无线码| 国产成人精品久久二区二区免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 美女大奶头黄色视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国产精品久久久人人做人人爽| 一区二区三区精品91| 看免费av毛片| 日本五十路高清| 欧美在线一区亚洲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99国产极品粉嫩在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 黄色a级毛片大全视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 伦理电影免费视频| 久热爱精品视频在线9| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲欧美激情在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产成人精品在线电影| 国产精品成人在线| 亚洲国产精品一区三区| 激情视频va一区二区三区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av一本久久久久| 999久久久精品免费观看国产| 成人免费观看视频高清| 老司机福利观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 五月天丁香电影| 亚洲久久久国产精品| 成人国语在线视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| videosex国产| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久久久久大尺度免费视频| 天堂中文最新版在线下载| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产野战对白在线观看| 精品福利永久在线观看| 我的亚洲天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 黑人操中国人逼视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产国语露脸激情在线看| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲天堂av无毛| 国产精品熟女久久久久浪| 18禁国产床啪视频网站| 成年人免费黄色播放视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲免费av在线视频| 999精品在线视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久影院123| 国产一级毛片在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 91成人精品电影| 欧美精品一区二区免费开放| 一本大道久久a久久精品| 十八禁网站免费在线| 大码成人一级视频| 久久久精品区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 中国国产av一级| 国产成人系列免费观看| 后天国语完整版免费观看| av不卡在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 大码成人一级视频| 12—13女人毛片做爰片一| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜日韩欧美国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 最新在线观看一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久人妻熟女aⅴ| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| a在线观看视频网站| 91九色精品人成在线观看| 人妻一区二区av| 人妻久久中文字幕网| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久天堂一区二区三区四区| 最新在线观看一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲少妇的诱惑av| 中国美女看黄片| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 制服诱惑二区| 色老头精品视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 黄片播放在线免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品久久久久久电影网| 动漫黄色视频在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产一区二区激情短视频 | 91字幕亚洲| 成人手机av| 一二三四在线观看免费中文在| 90打野战视频偷拍视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费少妇av软件| 操美女的视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 成年人黄色毛片网站| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 黄色a级毛片大全视频| 国产av一区二区精品久久| 亚洲国产av影院在线观看| 激情视频va一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美乱码精品一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 制服人妻中文乱码| 久热这里只有精品99| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产日韩欧美亚洲二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 一级黄色大片毛片| 天堂中文最新版在线下载| 男男h啪啪无遮挡| 黄色视频不卡| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 各种免费的搞黄视频| 亚洲伊人色综图| 制服诱惑二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 免费高清在线观看视频在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品国产国语对白av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 精品国内亚洲2022精品成人 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 91av网站免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产日韩一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| a级片在线免费高清观看视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成年美女黄网站色视频大全免费| 脱女人内裤的视频| 午夜福利,免费看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 啦啦啦免费观看视频1| 两人在一起打扑克的视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费人妻精品一区二区三区视频| 曰老女人黄片| 亚洲欧美精品自产自拍| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 我的亚洲天堂| 国产精品二区激情视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 少妇被粗大的猛进出69影院| 夫妻午夜视频| 一区福利在线观看| 国产片内射在线| kizo精华| 精品第一国产精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 2018国产大陆天天弄谢| 免费黄频网站在线观看国产| 成人国产av品久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本wwww免费看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 美女主播在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品国产乱码久久久久久男人| 无限看片的www在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 老司机深夜福利视频在线观看 | 午夜免费鲁丝| 捣出白浆h1v1| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一级毛片精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 桃红色精品国产亚洲av| 久久人人爽人人片av| 久久久久国内视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久性视频一级片| 国产一级毛片在线| 99热国产这里只有精品6| www.自偷自拍.com| 亚洲av男天堂| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av男天堂| 国产又爽黄色视频| svipshipincom国产片| 国产一卡二卡三卡精品| 久久久久久久久免费视频了| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品av麻豆狂野|