基于HPLC指紋圖譜與PLS-DA法評價(jià)新疆、云南產(chǎn)雪菊的質(zhì)量

黃 涵， 曾令杰， 馮鴻耀， 莫運(yùn)才， 郭玉梅， 廖素溪

（廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

基于HPLC指紋圖譜與PLS-DA法評價(jià)新疆、云南產(chǎn)雪菊的質(zhì)量

黃 涵， 曾令杰*， 馮鴻耀， 莫運(yùn)才， 郭玉梅， 廖素溪

（廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的 采用HPLC指紋圖譜和偏最小二乘判別分析 （PLS-DA）法對新疆、云南產(chǎn)雪菊質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。方法

雪菊；質(zhì)量評價(jià)；分類；HPLC指紋圖譜；PLS-DA

雪菊Coreopsis tinctoria Nutt.學(xué)名兩色金雞菊，是菊科金雞菊屬一年生草本植物［1］，主要分布于新疆昆侖山山系，迄今報(bào)道其藥理作用主要包括抗炎［2］、 抗氧化［3-4］、 降脂［5-6］、 降壓［7-8］、 降糖［9-10］等。近年來，市場對雪菊的需求量劇增，由于該植物野生產(chǎn)量稀少，故為滿足需要，新疆 （尤其是和田地區(qū)）、云南部分地區(qū)有一定規(guī)模的栽培［11］。

在我國，雪菊作為一種茶飲很受歡迎，對其研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性等方面，該植物的質(zhì)量評價(jià)雖有相關(guān)報(bào)道，但是大多僅以幾種活性成分含有量為評價(jià)指標(biāo)［12-13］。然而，雪菊化學(xué)成分較為復(fù)雜，若僅控制單一成分，難以保證臨床安全性和有效性，而且其指紋圖譜的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，因此有必要建立一種整體性的指紋圖譜測定方法，以更好地控制相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。

研究表明，偏最小二乘判別分析 （PLS-DA）法結(jié)合指紋圖譜在產(chǎn)地鑒別與質(zhì)量控制上具有一定優(yōu)勢，適合于樣品觀測數(shù)少、解釋變量多及存在著

多重共線性，而這些情況在中藥高效液相色譜數(shù)據(jù)中普遍存在［14］。尤為重要的是，當(dāng)變量之間存在高度相關(guān)性時(shí)，采用PLS-DA法所得到的結(jié)論更可靠，整體性更強(qiáng)，如HPLC-UV指紋圖譜結(jié)合PLSDA法用于新疆桃仁的質(zhì)量控制及分類［15］、PLSDA法對不同產(chǎn)地杜仲葉的質(zhì)量評價(jià)［16］、GC-MS結(jié)合PLS-DA模型對小白杏仁油脂種類和品質(zhì)進(jìn)行鑒別和監(jiān)控［17］等。

本實(shí)驗(yàn)將運(yùn)用HPLC指紋圖譜與PLS-DA法相結(jié)合的方式，用于實(shí)現(xiàn)新疆、云南兩個(gè)不同地區(qū)雪菊的分類，并根據(jù)PLS-DA模型的參數(shù)識別分類標(biāo)志物，為深層次的雪菊質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

島津LC-20AT HPLC色譜儀（包括四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）、BP211b電子天平 （日本島津公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗儀器 （昆山市超聲儀器有限公司）。綠原酸 （批號 MUST-13031401）、木犀草素 （批號MUST-13100401）對照品 （成都曼思特生物科技有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純。

20批雪菊分別采自新疆 （X1～X8）、云南（Y1～Y7）或購于市場 （S1～S5），經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院曾令杰教授鑒定為菊科金雞菊屬植物兩色金雞菊Coreopsis tinctoria Nutt.的頭狀花序。樣本分為訓(xùn)練集樣品 （共11個(gè)，包括6個(gè)新疆采集樣本X1～X6，5個(gè)云南采集樣本Y1～Y5）和驗(yàn)證集樣本 （共9個(gè)，包括2個(gè)新疆采集樣本X7、X8，2個(gè)云南采集樣本Y6、Y7，5個(gè)市場樣本S1～S5），具體見表1。

2 方法與條件

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流動相為乙腈 （A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫 （0～10 min，10%～18%A；10～35 min，18%～70%A；35～50 min，70%A；50～60 min，70%～10%A；60～70 min，10% A）；檢測波長350 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 m L/min；進(jìn)樣量10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取雪菊樣品適量，磨成粉末 （過3號篩），精密稱取0.25 g，置于50 m L具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，室溫下超聲提取50 min，再稱定質(zhì)量，70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表1 雪菊樣品來源Tab.1 Sources of Coreopsis tinctoria sam p les

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、木犀草素對照品適量，70%乙醇溶解，制成分別含綠原酸、木犀草素0.99、0.96 mg/mL的對照品貯備液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸、木犀草素為參照峰。結(jié)果，各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.59%，相對峰面積RSD均小于1.43%，符合指紋圖譜的要求，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，每8 h測定1次，重復(fù)6次，以綠原酸、木犀草素為參照峰。結(jié)果，各共有峰相對保留時(shí)間RSD均小于1.39%，相對峰面積RSD均小于2.27%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液進(jìn)行分析，檢測指紋圖譜，以綠原酸、木犀草素為參照峰。結(jié)果，各色譜峰相對保留時(shí)間RSD均＜0.73%，相對峰面積RSD均＜2.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的相似度評價(jià) 將11批訓(xùn)練集樣本

（X1～X6、Y1～Y5）的液相圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會指定的 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版”（圖1），將該軟件生成的雪菊共有模式與指紋圖譜對照，經(jīng)多點(diǎn)校正及色譜峰匹配，得到17個(gè)共有峰，匹配后進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表2。由圖、表可知，各樣本之間或與對照圖譜的相似度較高，都在0.983以上，反映雪菊中化學(xué)成分的分布及比例比較穩(wěn)定。以訓(xùn)練集樣本為例，它們與對照圖譜的相似度基本都在0.993以上，雖然均較高，但在圖中可觀察到樣品X1～X6與Y1～Y5的2、5、6、9、14、17號色譜峰的大小有所差異，其中X1～X6的2、6、9號峰明顯高于Y1～Y5，而5、14、17號峰明顯低于后者，這說明了色譜指紋圖譜不強(qiáng)調(diào)個(gè)體的絕對唯一性，而是注重同一藥材群體的相似性，即物種內(nèi)的唯一性，不分析樣品的實(shí)際情況，單純看相似度可能有歧義，如能結(jié)合判別分析則更有利于正確評價(jià)。另外，雖然該指紋圖譜符合要求，但通過相似度分析發(fā)現(xiàn)，樣品并未體現(xiàn)出很好的產(chǎn)地區(qū)分及質(zhì)量差異，盡管圖譜中主要峰群的整體面貌一致，但各成分含有量的相對比值不同，這可能受產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、栽培因素等影響。

圖1 訓(xùn)練集樣本 （X1～X6、Y1～Y5）的指紋圖譜和對照圖譜 （R）Fig.1 Fingerprints and referencemaps（R）of samples（X1-X6，Y1-Y5）in training set

表2 訓(xùn)練集11批樣本的相似度Tab.2 Sim ilarities of eleven sam p les in training set

3.2 PLS-DA分析 本實(shí)驗(yàn)以樣品中17個(gè)共有峰化學(xué)成分的含有量為X變量，以參與建模的各批雪菊樣品為Y變量，進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA分析。按照新疆、云南兩個(gè)產(chǎn)地的實(shí)際類別信息，將Y變量分為2類，建立HPLC色譜特征與其之間的PLS模型，峰面積數(shù)據(jù)經(jīng)SIMCA-P11.0軟件UV-scaling標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后進(jìn)行分析。

首先，利用訓(xùn)練集樣本建立PLS-DA識別模型，為驗(yàn)證其對未知樣本的適用性，將9個(gè)驗(yàn)證集樣本作為未知樣本，對模型進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)判別準(zhǔn)確率及與訓(xùn)練集判別是否一致來確定模型對未知樣本的適用性。然后，根據(jù)相關(guān)參數(shù)分別評價(jià)兩次建立的模型質(zhì)量。

在執(zhí)行多維統(tǒng)計(jì)分析建立PLS-DA模型時(shí)，軟件通常把數(shù)據(jù)分為7組，以其中6組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計(jì)算一個(gè)基本模型，用于預(yù)測另一組的準(zhǔn)確程度，并反復(fù)多次 （被預(yù)測的那組不重復(fù)）［18］，最后建立的模型是綜合所有模型的結(jié)果。由此，產(chǎn)生了評價(jià)模型的一些參數(shù)，如監(jiān)督模型解釋率 （R2Y）、模型預(yù)測能力 （Q2）［19］，理論上R2Y、Q2數(shù)值越接近1，說明模型越好，通常兩者高于0.5（50%）時(shí)較好。此外，置換檢驗(yàn)是用來評價(jià)PLS-DA模型準(zhǔn)確性的隨機(jī)排序方法，可避免監(jiān)督性方法獲得分類的偶然性。

圖2A為新疆、云南兩個(gè)地區(qū)PLS-DA模型訓(xùn)練集樣本的得分圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)地區(qū)的訓(xùn)練樣本被明顯區(qū)分，判別準(zhǔn)確率為100%，其中R2Y=0.993，Q2=0.978，可見該模型穩(wěn)定，預(yù)測能力較好。將模型建立時(shí)定義的分類Y矩陣的變量隨機(jī)排列20次，得到隨機(jī)的不同相應(yīng)Q2值作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)。通過置換檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)R2=0.321，Q2=-0.41，Q2負(fù)值表明模型可靠，

未存在過擬合現(xiàn)象，見圖2B。

然后，利用訓(xùn)練集和9個(gè)驗(yàn)證集作為未知樣本的驗(yàn)證集樣本一起建立模型。由圖3C可知，所有新疆產(chǎn)地樣本均被正確地判定為I類，云南產(chǎn)地樣本被判定為Ⅱ類，這與訓(xùn)練集判別結(jié)果一致，判別準(zhǔn)確率為100%。其中，R2Y=0.900，Q2=0.851，表明該模型有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測率；20次置換檢驗(yàn)中，R2=0.197，Q2=-0.405（圖3D），表明模型未過擬合。綜上所述，利用指紋圖譜結(jié)合PLS-DA法可對新疆、云南產(chǎn)雪菊進(jìn)行有效識別，為進(jìn)一步分析其內(nèi)在質(zhì)量差異提供基礎(chǔ)。

同時(shí)，為獲得影響新疆、云南兩個(gè)產(chǎn)地分類的變量 （色譜峰），對模型變量投影 （VIP）參數(shù)進(jìn)行分析，VIP＞1時(shí)表明影響顯著。各變量VIP得分圖 （圖4）表明，變量對分類的影響依次為Peak1＞Peak14＞Peak5＞Peak8＞Peak13＞Peak2＞Peak9＞Peak11＞Peak17＞Peak15＞Peak6＞Peak16＞Peak10＞Peak4＞Peak12＞Peak3＞Peak7。然后，將VIP大于1的11個(gè)峰（Peak1、Peak2、Peak5、Peak6、Peak8、Peak9、Peak11、Peak13、Peak14、Peak15、Peak17）作為分類標(biāo)志物。

圖2 訓(xùn)練集樣本的PLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖Fig.2 PLS-DA score p lot and permutation test p lot of samples in training set

4 討論

圖3 訓(xùn)練集與驗(yàn)證集樣本的PLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖Fig.3 PLS-DA score p lot and permu tation test p lot of sam ples in training set and test set

圖4 各變量（色譜峰）VIP得分圖Fig.4 VIP score p lot of variables（chromatographic peaks）

4.1 色譜條件的選擇 采用二極管陣列檢測器考察200～400 nm處不同檢測波長的圖譜。結(jié)果表明，350 nm處的圖譜清晰、特征性強(qiáng)、色譜信息豐富，考慮到雪菊中的主要成分為酚酸類和黃酮類化合物，因此選擇350 nm作為指紋圖譜的檢測波長。

另外，還考察了甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等多種流動相系統(tǒng)。結(jié)果表明，乙腈-磷酸水溶液流動相系統(tǒng)具有較好的分離效果，在此條件下峰形較好，基線較平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析。

4.2 提取方法考察 本實(shí)驗(yàn)考察了回流法、超聲提取法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取法比水浴回流提取法的收率高，而且操作方便。同時(shí)，對提取溶劑100%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取色譜峰的數(shù)量明顯減少，而其他溶劑提取效果大致相當(dāng)，考慮到乙醇毒性較小，故采用70%乙醇溶劑提取。

4.3 所建立指紋圖譜與雪菊質(zhì)量關(guān)聯(lián)性及應(yīng)用意義 本實(shí)驗(yàn)用指紋圖譜表征結(jié)合PLS-DA分析思路來闡釋藥物質(zhì)量，結(jié)果指認(rèn)出綠原酸、木犀草素，它們具有顯著的生物活性，與雪菊的質(zhì)量密切相關(guān)，如綠原酸 （peak2）具有抗菌消炎、保肝利膽等作用；木犀草素 （peak16）具有消炎、抗腫瘤等作用。而且，還將指紋圖譜和PLS-DA統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)不同地區(qū)雪菊的區(qū)分，并得到分類標(biāo)志物Peak1、Peak2、Peak5、Peak6、Peak8、Peak9、 Peak11、 Peak13、 Peak14、 Peak15、Peak17，這為雪菊產(chǎn)地的鑒別提供了一種新方法，也為深層次的相關(guān)質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

［1］ 新疆植物志編輯委員會.新疆植物志：第5卷［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：93.

［2］ Zhang Y，Shi S P，Zhao M，et al.Coreosides A-D，C14-polyacetylene glycosides from the capitula of Coreopsis tinctoria and its anti-inflammatory activity against COX-2［J］.Fitoterapia，2013，87：93-97.

［3］ 曹 燕，龐市賓，徐 磊，等.金雞菊提取物體外抗氧化活性［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（12）：144-147.

［4］ 魯曉翔.黃酮類化合物抗氧化作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：220-224.

［5］ 崔康康，姬鳳彩，王志琴，等.新疆昆侖雪菊水提液對大鼠血脂的影響［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（5）：366-370.

［6］ 梁淑紅，龐市賓，劉曉燕，等.金雞菊提取物降血脂作用的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（8）：234-235.

［7］ Sun Y H，Zhao J，Jin H T，et al.Vasorelaxant effects of the extracts and some flavonoids from the buds of Coreopsis tinctoria［J］.Pharm Biol，2013，51（9）：1158-1164.

［8］ 梁淑紅，哈木拉提，龐市賓，等.金雞菊提取物降血壓化學(xué)成分實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，21（7）：1619-1621.

［9］ Dias T，Bronze M R，Houghton P J，et al.The flavonoid-rich fraction of Coreopsis tinctoria promotes glucose tolerance regain through pancreatic function recovery in streptozotocin-induced glucose-intolerant rats［J］.JEthnopharmacol，2009，132（2）：483-490.

［10］ Dias T，Mota-Filipe H，Liu B，et al.Recovery of oral glucose tolerance by Wistar rats after treatment with Coreopsis tinctoria infusion［J］.Phytotherapy Research，2010，24（5）：699-705.

［11］ 過利敏，張 平，張 謙，等.雪菊化學(xué)成分分析、提取、鑒定、及其生物活性研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2014，35（7）：298-304.

［12］ 張彥麗，王 艷，李新霞，等.高效液相法測昆侖雪菊中綠原酸和黃芩苷的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（4）：107-109.

［13］ 王 亮，王 濤，郭巧生，等.昆侖雪菊與杭菊、貢菊主要活性成分比較［J］.中國中藥雜志，2013，38（20）：3342-3445.

［14］ 齊 方，蓉 蓉，薛付忠.中藥藥性特征標(biāo)記的PLS統(tǒng)計(jì)模式識別模型［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，2011，28（6）：628-637.

［15］ 云 琦，劉青旺，馬小華，等.新疆桃仁HPLC-UV指紋圖譜研究在地區(qū)分類中的應(yīng)用［J］.中國中藥雜志，2014，39（5）：860-866.

［16］ 王 莉，段曉芳，敬海英，等.指紋圖譜和主成分分析法評價(jià)杜仲葉的質(zhì)量［J］.華西藥學(xué)雜志，2012，27（2）：190-192.

［17］ 田洪磊.新疆小白杏杏仁生物活性物質(zhì)指紋圖譜及生物學(xué)功能研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2013.

［18］ 賈 偉.醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2011.

［19］ 姜 輝，吳芙蓉，高家榮，等.疏肝健脾方對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠尿液代謝組學(xué)的影響［J］.中成藥，2014，36（12）：2457-2462.

Quality evaluation of Coreopsis tinctoria in Xinjiang and Yunnan based on HPLC fingerprint and PLS-DA

HUANG Han， ZENG Ling-jie*， FENG Hong-yao， MO Yun-cai， GUO Yu-mei， LIAO Su-xi

（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 51OOO6，China）

AIM To evaluate the quality of Coreopsis tinctoria in Xinjiang and Yunnan by HPLC fingerprint and partial least-squares discriminant analysis（PLS-DA）.M ETHODS The analysis of C.tinctoria extractwas performed on Agilent TC-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm），mobile phase was acetonitrile-0.1%H3PO4aqueous solution with gradient elution，flow rate was1.0 mL/min，column temperature wasmaintained at30℃，and detection wavelength was set at 254 nm.RESULTS The similarities of eleven samples in training set were more than 0.983.PLS-DA could significantly distinguish the samples from Xinjiang and Yunnan.Moreover，eleven constituents（chromatographic peaks）were taken as classification markers.CONCLUSION Thismethod is simple，stable and feasible，which can be used for the quality control and classification of Coreopsis tinctoria.

Coreopsis tinctoria；quality evulation；classification；HPLC fingerprint；PLS-DA

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2710-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.029

2015-04-28

廣東藥學(xué)院中青年骨干教師培養(yǎng)項(xiàng)目 （2012JDX01）

黃 涵 （1989—），男，碩士，從事生藥活性成分與質(zhì)量評價(jià)研究。Tel：15876571918，E-mail：316307565@qq.com

*通信作者：曾令杰（1970—），男，博士，教授，從事中藥質(zhì)量評價(jià)研究。E-mail：zlj334477@aliyun.com

雪菊提取液分析采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長350 nm。結(jié)果 11批訓(xùn)練集樣品的相似度均大于0.983，PLS-DA法可顯著區(qū)分新疆、云南兩個(gè)產(chǎn)地的雪菊，有11個(gè)成分 （色譜峰）為分類標(biāo)志物。結(jié)論 該方法簡便、穩(wěn)定、可行，可用于雪菊的質(zhì)量評價(jià)及分類。