HPLC法同時測定活血通脈片中4種成分

趙培敬， 張桂平

（南陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南南陽473061）

HPLC法同時測定活血通脈片中4種成分

趙培敬， 張桂平

（南陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南南陽473061）

目的 建立同時測定活血通脈片 （雞血藤、丹參、赤芍、紅花等）中4種活性成分丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A及橙皮苷的HPLC法。方法 活血通脈片70%甲醇提取液的分析采用Welchrom C18色譜柱；乙腈-0.1%磷酸為流動相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為230 nm。結(jié)果 丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、橙皮苷的線性范圍分別為23.91～143.46μg/mL（r=0.999 8）、5.62～33.75μg/mL（r=0.999 4）、2.61～15.66μg/mL（r=0.999 1）、19.10～114.60μg/mL（r=0.999 7），平均回收率分別為98.5%、98.8%、97.9%、99.2%，RSD分別為1.2%、1.4%、1.0%、0.92%。結(jié)論 本法對方中4味主藥的特征性成分同時進(jìn)行測定，簡便實(shí)用，靈敏準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

活血通脈片；丹酚酸B；芍藥苷；羥基紅花黃色素A；橙皮苷；HPLC

活血通脈片為 《中國藥典》收載品種［1］，由雞血藤、丹參、赤芍、紅花、降香、陳皮、川芎、郁金、麥冬等藥味制成，具有行氣活血，通脈止痛的功效，臨床用于冠心病、心絞痛、氣滯血瘀證的治療。原標(biāo)準(zhǔn)中僅控制了丹酚酸B的含有量，而關(guān)于方中其他成分定量測定的研究也有報道［2-4］，但多以單味藥的單一成分作為質(zhì)控目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［5-7］，對樣品處理方法和色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，對方中4味主藥丹參、赤芍、紅花、陳皮的特征性成分同時進(jìn)行測定，可在簡化檢測步驟、節(jié)約檢測資源的情況下，更好地把關(guān)該藥品的質(zhì)量。結(jié)果表明，該法簡便實(shí)用、重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于該藥品質(zhì)量的有效控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元梯度泵、G1314F型可變波長紫外檢測器；Sartorious BP-211D電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波儀。

1.2 試藥 實(shí)驗(yàn)中所用對照品皆購自中國食品藥品檢定研究院，分別為丹酚酸B（111562-201110，純度 98.0%）、芍藥苷 （110736-201035，純度96.5%）、羥基紅花黃色素 A（批號 111637-200905，純 度 91.8%）、 橙 皮 苷 （110721-200512）。

1.3 試劑與樣品 乙腈為色譜純（Welch Materials Inc.）；其它試劑均為分析純；水為超純水?；钛}片樣品皆由市場購得。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、橙皮苷對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 0.478 2 mg、橙皮苷0.382 0 mg、芍藥苷0.112 5 mg、羥基紅花黃色素A 0.052 2 mg的混合對照品溶液，作為對照品貯備液。精密吸取2 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，精密稱取0.4 g，置20 mL量瓶中，加70%甲醇適量，密塞，超聲提取30 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按處方制法，制備分別不含丹參、赤芍、紅花、陳皮的陰性對照樣品，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法分別制成缺丹參、缺赤芍、缺紅花、缺陳皮的陰性對照溶液。

2.2 色譜條件 Welchrom C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B）系統(tǒng)，梯度洗脫 （0～12 min，12%A；12～20 min，12%→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%→12%A）；檢測波長230 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL。按羥基紅花黃色素峰計(jì)算，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 吸取 “2.1”項(xiàng)下3種溶液各10μL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果在供試品色譜中，出現(xiàn)與丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、橙皮苷對照品色譜相同、保留時間一致的色譜峰，并且與其它組分能達(dá)到良好分離，分離度均符合藥典要求，理論塔板數(shù)分別為13 981、9 386、7 815、12 255。而在陰性對照色譜中，與各對照品色譜峰相應(yīng)的位置上無干擾峰，說明供試品溶液中的其它組分對待測成分無影響，見圖1。

圖1 對照品 （A）、供試品 （B）、缺紅花陰性對照 （C）、缺赤芍陰性對照 （D）、缺陳皮陰性對照 （E）、缺丹參陰性對照（F）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A），sample（B），samplew ithout Carthami flos（C），samplew ithout Paeoniae rub rae Radix（D），sam p le w ithou t Citri reticulatae Pericarpium（E）and sam p le w ithout Salviaem iltiorrhizae Radix et Rhizoma（F）

2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取 “2.1.1”項(xiàng)下對照品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，在 “2.2”項(xiàng)色譜條件下測定，以測得的4種成分的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度 （μg/m L）為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。芍藥苷回歸方程為Y=10.293 9X-0.694 2，r=0.999 4（n=6）；羥基紅花黃色素A回歸方程為Y=16.091 1X-1.292 3，r=0.999 1（n=6）；丹酚酸B回歸方程為Y= 10.396 2 X+0.973 1，r=0.999 8（n=6）；橙皮苷回歸方程為Y=10.035 2X-1.074 9，r=0.999 7（n=6）。結(jié)果表明，芍藥苷、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、橙皮苷分別在5.62～33.75μg/mL、2.61～15.66μg/mL、23.91～143.46μg/mL、19.10～114.60μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取 “2.1.1”項(xiàng)下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、橙皮苷4種成分的峰面積RSD分別為0.88%、1.1%、1.5%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為10140327的樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定。結(jié)果，丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、橙皮苷的RSD分別為1.3%、0.69%、1.5%、1.2%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為10140327的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h測定4種成分的峰面積。結(jié)果，丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、橙皮苷的RSD分別為0.94%、1.1%、1.6%、1.2%，表明制備的供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測得含有量（丹酚酸B 2.381 mg/片，芍藥苷0.567 mg/片，羥基紅花黃色A 0.262 mg/片，橙皮苷1.855 mg/片，

片質(zhì)量0.497 6 g）的活血通脈片6份，每份0.2 g，分別精密加入 “2.1.1”項(xiàng)下的對照品貯備液各2.0 mL，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 樣品測定 取不同廠家共12批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定4種成分的含有量，結(jié)果見表2。

表2 12批樣品中4種成分的測定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Results of four constituentsmeasured in twelve batches of samples（n=3）

從所測得的結(jié)果可以看到，不同廠家12批樣品在丹酚酸B含有量上的差別不大，而其他3種成分的含有量則差異偏大，尤其是羥基紅花黃色素A的含有量，差距達(dá)4倍多，超出了正常的不同廠家生產(chǎn)、不同產(chǎn)地藥材所帶來的可能差異。之所以出現(xiàn)這種情況，可歸因于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了丹酚酸B的含有量，而其他3味藥因原標(biāo)準(zhǔn)中未涉及成分定量控制，造成個別廠家鉆空子、不嚴(yán)格按工藝投料，以致生產(chǎn)的成藥中各成分含有量差異較大，質(zhì)量參差不齊，所以很有必要對其合理定量，從而更好地監(jiān)管該藥品的質(zhì)量。

3 討論

關(guān)于多成分的同時檢測，在已有的研究中很多采用波長轉(zhuǎn)換的方式，取得了良好的效果［8-11］，本實(shí)驗(yàn)也采用了此種方法，以各成分的最大吸收波長為各自的檢測波長進(jìn)行測定，效果較好。同時，也嘗試了以4種成分中任一成分的最大吸收波長為單一檢測波長的測定方法，發(fā)現(xiàn)以230 nm作為檢測波長時，其它3種成分亦響應(yīng)信號強(qiáng)、吸收穩(wěn)定，效果并不比波長轉(zhuǎn)換的差。故考慮到部分品牌或型號的儀器在波長轉(zhuǎn)換時基線不能自動回零，造成基線不穩(wěn)，亦本著舍繁從簡的原則，最終采用了單波長檢測的方式。

方中川芎的特征性成分阿魏酸在理論上，可以與文中的4種成分同時檢測［12-13］，所以一開始的實(shí)驗(yàn)也將其作為待測成分進(jìn)行了測定，但結(jié)果很不理想，因?yàn)槠浜辛刻?，與其它幾種成分懸殊太大，甚至在幾個批次的樣品中檢測不到，同批樣品中的含有量平行性也很差。究其原因，應(yīng)該是由于川芎在方中所占比例較小，而阿魏酸在川芎中含有量又低，并且性質(zhì)不穩(wěn)定［14］。鑒于此，阿魏酸不宜作為本次實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)成分用于質(zhì)量控制，故最終僅做4種成分的檢測。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：38，958-960.

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膠囊中丹酚酸B、葛根素和芍藥苷的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（5）：887-890.

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Sim ultaneous determ ination of four active constituents in Huoxue Tongm ai Tablets by HPLC

ZHAO Pei-jing， ZHANG Gui-ping

（Nanyang Institute for Food and Drug Control，Nanyang 473O61，China）

AIM To develop an HPLCmethod for the simultaneous determination of the contents of four active constituents（salvianolic acid B，paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and hesperidin）in Huoxue Tongmai Tablets（Jixuezeng Radix et Caulis，Salviaemiltiorrhizae Radix，Paeoniae rubrae Radix，Carthami flos，etc.）.

Huoxue Tongmai Tablets；salvianolic acid B；paeoniflorin；hydroxysafflor yellow A；hesperidin；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）12-2651-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.017

2015-03-18

趙培敬（1975—），男，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與提高。Tel：13938993643，E-mail：peijingzhao@126.com

METHODS The analysis of70%methanolic extractof Huoxue Tongmai Tabletswas conducted on aWelchrom C18column with acetonitrile-0.1%phosphoric acid asmobile phase in a gradient elution mode at a flow rate of 1.0 mL/min and a detection wavelength of230 nm.RESULTS The linear ranges of salvianolic acid B，paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and hesperidin were 23.91-143.46μg/mL（r=0.999 8），5.62-33.75 μg/mL（r=0.999 4），2.61-15.66μg/mL（r=0.999 1）and 19.10～114.60μg/mL（r=0.999 7），respectively.Their average recovery rates were 98.5%，98.8%，97.9%and 99.2%，and RSDs were 1.2%，1.4%，1.0%and 0.92%，respectively.CONCLUSION Being simple，accurate and reproducible，thismethod is well suited to the simultaneous determination of characteristic constituents of four herbs in Huoxue Tongmai Tablets.