LC-MS-MS法同時(shí)測定黃芪注射液和黃芪口服液中5種成分

儲繼紅， 李長印， 戴國梁， 居文政

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇南京210029）

［質(zhì) 量］

LC-MS-MS法同時(shí)測定黃芪注射液和黃芪口服液中5種成分

儲繼紅， 李長印， 戴國梁， 居文政*

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇南京210029）

目的 建立LC-MS-MS法同時(shí)測定黃芪注射液和黃芪口服液中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素5種有效成分的含有量。方法 黃芪注射液和黃芪口服液甲醇稀釋液在Agilent ZORBAX SB C18（2.1 mm×150 mm，5μm）色譜柱上分離，流動相為甲醇-水 （含0.1%甲酸，70∶30，V/V）；體積流量為300 μL/m in。MS采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行正離子掃描。結(jié)果 5種成分在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，在黃芪注射液和黃芪口服液中的平均回收率分別為96.8%～102.3%和95.9%～101.5%。結(jié)論 本法測得結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，可用于黃芪注射液和黃芪口服液的質(zhì)量控制。

黃芪注射液；黃芪口服液；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；芒柄花黃素；LC-MS-MS

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，主要含皂苷類、黃酮類、多糖類及氨基酸類等成分，性溫，味甘，歸肝、脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、抗瘡生肌等功效［1-3］?，F(xiàn)代藥學(xué)工藝的發(fā)展，使傳統(tǒng)中藥以新的劑型問世，黃芪注射液和黃芪口服液便是從黃芪

中提取有效成分制成的制劑，可增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張冠狀動脈，保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心臟功能；增加超氧化歧化酶活性，清除自由基；抑制血小板凝聚，降低血液黏稠度，改善微循環(huán)；增強(qiáng)腎上腺素皮質(zhì)功能，改善腎臟功能；防止肝糖原減少，保護(hù)肝臟，在臨床有廣泛的應(yīng)用［4-6］。

在黃芪制劑的質(zhì)量控制方面，測定黃芪甲苷的方法比較多［3，7-13］。為了更全面的評價(jià)制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS-MS法同時(shí)測定制劑中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的含有量，為黃芪注射液和黃芪口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)，也更符合中醫(yī)藥多組分、多靶點(diǎn)作用模式和整體性理論。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent6430 Triple Quad LC/MS（美國Agilent公司，MassHunter Workstation Sofeware，Version B.05.00），配有ESI源、1200型二元梯度泵和自動進(jìn)樣器；梅特勒MT-5電子天平；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)；Drict-Q5超純水機(jī)。

1.2 試藥 黃芪甲苷 （批號0781-200311）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷 （批號111920-201102）和內(nèi)標(biāo)異鼠李素-3-0-新橙皮苷 （批號110860-200204），購自中國藥品生物制品檢定所；芒柄花苷 （批號120810）和毛蕊異黃酮 （批號120716），購自鼎瑞化工 （上海）有限公司；芒柄花黃素 （批號MUST-11050801），購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院。黃芪口服液為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑 （10 mL/支）；黃芪注射液由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn) （10 mL/支）；甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相條件 Agilent ZORBAX SB C18（2.1 mm×150 mm，5μm）色譜柱；流動相為甲醇-水（含0.1%甲酸，70∶30，V/V）；體積流量300 μL/min；進(jìn)樣量2μL；柱溫35℃。

2.2 質(zhì)譜條件 ESI源，正離子模式檢測；毛細(xì)管電壓4 000 V；源溫350℃；干燥氣10 L/min；霧化氣20 psi（1 psi=6.895 kPa）；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM）。用于定量分析的離子對分別為黃芪甲苷，［M+Na］+，m/z 807.5→807.5（fragmentor 220 V，collision energy 20 V）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷，［M+H］+，m/z 447.1→285.1（fragmentor 110 V，collision energy 20 V）；芒柄花苷，［M+H］+，m/z431.2→269.0（fragmentor 110 V，collision energy 20 V）；毛蕊異黃酮，［M+H］+， m/z285.1→213.1（fragmentor 170 V，collision energy 40 V）；芒柄花黃素，［M+H］+，m/z 269.1→197.1（fragmentor 170 V，collision energy 40 V）；內(nèi)標(biāo)異鼠李素-3-0-新橙皮苷， ［M+H］+，m/z 647.3→331.3（fragmentor 130 V，collision energy 30 V）。

2.3 對照品溶液的配制 稱取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素適量，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液，4℃冰箱保存。

分別取上述對照品貯備液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含黃芪甲苷10.16μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.872μg、芒柄花苷1.044μg、毛蕊異黃酮0.661 4μg、芒柄花黃素0.251 6μg的混合對照品母液。

另稱取異鼠李素-3-0-新橙皮苷適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)貯備液，并用甲醇稀釋至0.904 0μg/mL。

2.4 供試品溶液的配制 取黃芪注射液0.1 mL，用甲醇稀釋20倍，即得。取黃芪口服液0.1 mL，用甲醇稀釋200倍，取1 mL稀釋液于1.5 mL塑料離心管中，13 800×g離心5 min，取上清液，即得。

各樣品進(jìn)樣分析前，與0.904 0μg/mL內(nèi)標(biāo)異鼠李素-3-0-新橙皮苷甲醇溶液按體積比1∶1渦旋混合30 s，在 “2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下分析。

2.5 專屬性試驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)條件下，所測5種有效成分峰型良好無干擾，見圖1。從圖中可看出，毛蕊異黃酮 （峰5）的左側(cè)有一個(gè)與毛蕊異黃酮葡萄糖苷 （峰3）保留時(shí)間一致的色譜峰，此峰是由毛蕊異黃酮葡萄糖苷產(chǎn)生，因?yàn)槊锂慄S酮葡萄糖苷可先形成285.1的碎片離子，繼而形成213.1的碎片離子。同樣，芒柄花黃素 （峰6）左側(cè)與芒柄花苷 （峰4）保留時(shí)間一致的色譜峰是由芒柄花苷產(chǎn)生的。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.3”項(xiàng)下混合對照品母液適量，用甲醇稀釋成系列濃度混合對照品溶液，與0.904 0μg/mL內(nèi)標(biāo)異鼠李素-3-0-新橙皮苷甲醇溶液按體積比1∶1渦旋混合30 s，在“2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下分析，以對照品質(zhì)量濃度 （X）為橫坐標(biāo)，待測物峰面積As與內(nèi)標(biāo)峰面積Ais的比值 （Y）為縱坐標(biāo)，作加權(quán)線性回歸計(jì)算。結(jié)果表明，各成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各成分線性范圍為黃芪甲苷0.079 4～

5.080μg/mL（r=0.997 9）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.029 2～1.872μg/m L（r=0.998 0）；芒柄花苷0.008 2～0.522 0μg/mL（r=0.999 2）；毛蕊異黃酮0.005 2～0.330 7μg/mL（r=0.999 6）；芒柄花黃素0.002 0～0.125 8μg/mL（r=0.999 7）。

圖1 甲醇空白、混合對照品、黃芪注射液、黃芪口服液的LC-MS-MS圖Fig.1 LC-MS-MS chromatograms of methanol，m ixed reference substances，Astragalus Injection and Astragalus O ral L iquid

2.7 精密度試驗(yàn) 取 “2.3”項(xiàng)下混合對照品母液適量，用甲醇稀釋為含黃芪甲苷 0.635 0 μg/mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.117 0μg/mL，芒柄花苷0.065 2μg/mL，毛蕊異黃酮0.041 3 μg/mL，芒柄花黃素0.015 7μg/m L的混合對照品溶液，在 “2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，將峰面積比值代入當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，求得精密度。結(jié)果表明，儀器精密度良好，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的RSD值分別為3.1%、2.1%、3.4%、4.1%和4.5%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批號黃芪注射液（批號為 1212053） 和黃芪口服液 （批號為1304003），按 “2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，分別在 “2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下分析，測定各化合物的含有量。結(jié)果，黃芪注射液和黃芪口服液中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的RSD值分別為3.3%和4.8%、3.8%和2.7%、4.7%和2.4%、4.9%和3.0%、4.2%和3.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一批號黃芪注射液（批號為 1212053） 和黃芪口服液 （批號為1304003），按 “2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，在室溫下放置0、2、4、8、12 h，在 “2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣分析，代入當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的RSD值分別為3.3%和2.9%、2.6%和3.9%、2.9%和4.1%、4.2%和3.3%、3.5%和4.0%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn) 取成分含有量已知的同一批號黃芪注射液 （批號為1212053）0.1 mL，加入適當(dāng)濃度混合對照品溶液0.1 mL，混勻，用甲醇稀釋20倍。另取成分含有量已知的同一批號黃芪口服液 （批號為1304003）0.1 mL，加入適當(dāng)濃度混合對照品溶液0.1 mL，混勻，用甲醇稀釋200倍，取1 m L稀釋液于1.5 m L塑料離心管中，13 800× g離心5 min，取上清液，分別平行制備5份。再

按體積比1∶1加入0.904 0μg/mL內(nèi)標(biāo)異鼠李素-3-0-新橙皮苷甲醇溶液渦旋混合30 s，在 “2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下分析，結(jié)果見表1、表2。

表1 黃芪注射液加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of recovery tests for Astragalus Injection（n=5）

表2 黃芪口服液加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=5）Tab.2 Results of recovery tests for Astragalus Oral Liquid（n=5）

2.11 樣品測定 分別吸取3個(gè)批次的黃芪注射液和黃芪口服液，按 “2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.1”和 “2.2”項(xiàng)條件下分析測定，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分的含有量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 （μg，n=3）Tab.3 Results of the determ ination of sam p les（μg，n=3）

3 討論

據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，對黃芪注射液和黃芪口服液的質(zhì)量控制大多采用高效液相色譜法測定其中的黃芪甲苷［5-6，8］。由于中藥是復(fù)雜體系，經(jīng)多成分多途徑協(xié)同作用發(fā)揮藥效，因此建立多組分同時(shí)定量的分析方法，對全面控制中藥制劑的質(zhì)量具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS-MS法，對黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花黃素、芒柄花苷進(jìn)行同時(shí)定量分析。由于黃芪甲苷 ［M+ H］+響應(yīng)較差，故選擇 ［M+Na］+模式，因［M+Na］+峰在二級質(zhì)譜很難產(chǎn)生碎片離子，所以采用m/z807.5→807.5進(jìn)行檢測。其他4個(gè)化合物 ［M+H］+響應(yīng)較好，二級質(zhì)譜均有碎片離子。該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，分離效果理想，精密

度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率均符合測定要求，有利于進(jìn)一步完善黃芪注射液和黃芪口服液的質(zhì)量控制及相關(guān)研究。

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Sim ultaneous determ ination of five com ponents in Astragalus Injection and Astragalus Oral Liquid by LC-MS-MS

CHU Ji-hong， LIChang-yin， DAIGuo-liang， JUWen-zheng*

（0 fficeof Clinical Pharmacology，Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM，Nanjing 21OO29，China）

AIM To establish an LC-MS-MS method for simultaneously determining the contents of astragaloside，calycosin-7-glucosid，ononin，calycosin and formononetin in Astragalus Injection and Astragalus Oral Liquid（Astragalusmembranaceus）.METHODS The determination of aforementioned components in Astragalus Injection and Astragalus Oral Liquid methnol diluents were performed on an Agilent ZORBAX SB C18（2.1 mm× 150 mm，5μm）with themobile phase consisting ofmethanol and water（containing 0.1%formic acid，70∶30，V/V）delivered at a flow rate of300μL/min.Electrospray ionization（ESI）interface and multiple reaction monitoring（MRM）were applied to the positive ion mode.RESULTS The five constituents demonstrated good linear relationships with their recoveries kept within the ranges of 96.9%-102.3%for Astragalus Injection and 95.9%-101.5%for Astragalus Oral Liquid.CONCLUSION Thismethod is accurate，reliable and sensitive，and can be used for the quality control of Astragalus Injection and Astragalus Oral solution.

Astragalus Injection；Astragalus Oral Liquid；astragaloside，calycosin-7-glucosid，ononin，calycosin，formononetin；LC-MS-MS

R927.2

A

1001-1528（2015）12-2647-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.016

2015-04-16

江蘇省自然科學(xué)基金 （青年基金）項(xiàng)目 （BK20131035）；江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才項(xiàng)目 （LJ200906）；國家科技部 “重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目（2012ZX09303009-002）

儲繼紅，女，助理研究員，研究方向?yàn)榕R床藥代動力學(xué)。Tel：（025）86617141-50521，E-mail：cjh124@sina.com.cn

*通信作者：居文政，男，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幣R床藥代動力學(xué)。Tel：（025）86617141-50518，E-mail：juwz333@hotmail.com