HPLC-DAD測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)

嚴建業(yè)， 王元清， 黃 丹， 韓 彬， 張 陳， 向 榮， 孫 琴， 夏新華*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化重點實驗室，湖南長沙410208；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實驗室，湖南長沙410004；3.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南長沙410208；4.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006；5.暨南大學(xué)藥學(xué)院2014級研究生，廣東廣州510632）

HPLC-DAD測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)

嚴建業(yè)1， 王元清2， 黃 丹3， 韓 彬4*， 張 陳5， 向 榮2， 孫 琴2， 夏新華1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化重點實驗室，湖南長沙410208；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實驗室，湖南長沙410004；3.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南長沙410208；4.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006；5.暨南大學(xué)藥學(xué)院2014級研究生，廣東廣州510632）

目的 測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù) （lg Papp）。方法 采用高效液相色譜法測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在不同pH緩沖溶液中的平衡溶解度；采用搖瓶法結(jié)合高效液相色譜法測定其在正辛醇-水及緩沖鹽溶液中的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果 虎杖苷、白藜蘆醇均在pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，大黃素在pH為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大；虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在正辛醇飽和的水中l(wèi)g Papp值分別為0.98、2.69、0.99，在不同pH的磷酸鹽緩沖液中，虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素的油水分配系數(shù)范圍分別為0.84～1.01、2.34～2.89、0.97～1.27。結(jié)論 在胃腸道生理條件下，虎杖苷與大黃素的吸收較好，白黎蘆醇的吸收較差；從溶解性能看，大黃素的溶解性能較差，可改善其溶解性能進一步提高其生物利用度。

虎杖苷；白藜蘆醇；大黃素；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；HPLC-DAD

虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素為虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.中主要藥效成分，具有抗炎、抗氧化［1-2］、抗癌、抗腫瘤［3-4］、抑制血小板凝聚［5-6］、調(diào)節(jié)脂蛋白代謝［7］等功效，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 虎杖苷 （A）、白藜蘆醇 （B）和大黃素 （C）的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of polydatin（A），resveratrol（B），and emodin（C）

一直以來，虎杖中的化學(xué)成分、藥理作用、臨床療效等方面研究都是國內(nèi)外許多學(xué)者研究的重點，而且目前關(guān)于這3種成分的藥動學(xué)及其理化性質(zhì)方面均有相關(guān)研究報道［8-10］，但虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素這3種成分的油水分配系數(shù)等理化常數(shù)暫無相關(guān)報道。由于藥物的理化參數(shù)與其在生物體內(nèi)膜滲透性密切相關(guān)，影響藥物代謝動力學(xué)特征與指導(dǎo)劑型設(shè)計，故為進一步開發(fā)虎杖的藥用價值，指導(dǎo)其合理用藥，本實驗測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的表觀油水分配系數(shù)及平衡溶解度，以期為虎杖中這3種成分的吸收代謝與新劑型的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；SHY-2 S旋轉(zhuǎn)水浴恒溫振蕩器 （江蘇省金壇市大地自動化儀器廠）；T-214電子分析天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

虎杖苷 （批號131121，純度＞98%）、白藜蘆醇 （批號131021，純度＞98%）、大黃素 （批號130410，純度＞98%）均購于成都普菲德生物科技有限公司；乙腈 （色譜純，美國Tedia公司）；甲醇 （色譜純，美國Tedia公司）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 不同pH磷酸緩沖溶液的配制 按 《中國藥典》2010年版附錄［11］配制pH分別為2.0、2.5、5.0、5.8、6.5、6.8、7.8系列的磷酸鹽緩沖液；另取氯化鈉1 g，量取濃鹽酸3.5 mL置于500 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻配制成pH 1.2的緩沖液。

2.1.2 對照品溶液的制備 取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對照品適量，精密稱定置于棕色量瓶中，分別加甲醇超聲溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為61、1.17、10.3μg/mL的對照品溶液，備用。

2.2 虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素的測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗［12］Agligent TC-C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6mm）；體積流量0.9 mL/min；進樣量10μL；柱溫30℃；流動相與檢測波長見表1。色譜圖見圖2。

表1 各化合物色譜條件Tab.1 HPLC conditions for the components

2.2.2 線性關(guān)系的考察 取虎杖苷對照品 （61 μg/mL）、白藜蘆醇對照品（1.17μg/mL）、大黃素對照品 （10.3μg/mL）溶液均進樣2、4、6、8、10、12μL，按 “2.1”項下的色譜條件測定峰面積，以各成分峰面積為縱坐標，對照品的進樣量（μg）為橫坐標繪制標準曲線，得虎杖苷的回歸方程為Y=3.7595X+747.27，r=0.999 7；白藜蘆醇的回歸方程為Y=9.235X+0.84，r=0.999 6；大黃素的回歸方程為Y=3.915 5X-1.98，r=0.998 1。結(jié)果表明，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素分別在122～732 ng、2.34～14.04 ng、20.6～123.6 ng范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖2 對照品 （A）與樣品 （B）的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of reference substances（A）and sam p les（B）

2.2.3 精密度試驗 精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對照品溶液 （質(zhì)量濃度分別為61、1.17、10.3μg/mL）各10μL，按照 “2.2.1”項的色譜條件重復(fù)進樣6次，測定其峰面積，計算RSD，其RSD分別為1.63%、1.85%、1.79%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 取已知含有量的虎杖苷樣品、白藜蘆醇樣品、大黃素樣品溶液2.0 mL，各6份，分別精密加入與樣品中成分含有量相當?shù)膶φ掌?，制成供試品溶液，按?“2.2.1”項的色譜條件進行測定，計算其平均回收率分別為99.3%、98.1%、98.2%，RSD分別為 1.4%、1.3%、1.3%，表明方法準確可靠。

2.3 平衡溶解度的測定 分別取過量的虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對照品置于10 mL試管中，加pH為7.8、6.8、6.5、5.8、5.0、2.5、2.0、1.2的磷酸鹽緩沖液各2 mL，將試管放入恒溫振蕩器中，控制溫度37℃，100 r/min振搖24 h，4 000 r/min離心10 min。取上清液分別適當稀釋后，按上述色譜條件進樣分析，測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在不同pH的緩沖溶液中的量，并計算其在不同緩沖溶液介質(zhì)中的平衡溶解度。結(jié)果見圖3。

由圖3可知，虎杖苷、白藜蘆醇均在pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，隨著pH增大，其溶解度的整體變化趨勢是先增大再減小，然后又增大再減小。大黃素在pH為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，該成分的溶解度受pH敏感，在pH 5.0與pH 7.8時的溶解度接近，在pH 5.8與pH 1.2時的溶解度接近。從溶解度絕對數(shù)值來看，虎杖苷＞白黎蘆醇＞大黃素，表明虎杖苷在各緩沖溶液中的溶解性能強于白黎蘆醇，白黎蘆醇強于大

黃素。

圖3 虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素在不同pH的磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度Fig.3 Equilibrium solubilities of polydatin，resveratrol and emodin in phosphate buffer solutions of different pH values

2.4 油水分配系數(shù)的測定 取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對照品適量，精密稱定，分別置于25 mL棕色量瓶中，加水飽和的正辛醇溶液超聲溶解，定容至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為 0.58、0.424、0.252 mg/m L的供試品貯備液，備用。分別精密吸取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的水飽和正辛醇溶液2 mL，分別置于具塞試管中，分別加入2 mL正辛醇飽和水及不同pH的磷酸鹽緩沖液，將試管放入恒溫振蕩器中，控制溫度37℃，100 r/min振搖24 h。取下層水相4 000 r/min離心10 min，進樣進行測定，記錄峰面積，計算虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素質(zhì)量濃度，并按下式計算其表觀油水分配系數(shù)。

其中Papp為表觀油水分配系數(shù)，C1為藥物的總質(zhì)量濃度 （μg/mL），C0為藥物分配平衡后在油相中所測得的質(zhì)量濃度，Cw為藥物分配平衡時在水相中測得的質(zhì)量濃度。測定結(jié)果見表2。

表2 虎杖苷、白藜蘆醇與大黃素的油水分配系數(shù)測定結(jié)果Tab.2 N-octanol/w ater partition coefficients of polydatin，resveratrol and emodin in different solutions

由表2可知，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在正辛醇飽和的水溶液中l(wèi)g Papp值分別為0.98、2.69、0.99；虎杖苷與白藜蘆醇在pH 1.2～2.5的緩沖溶液范圍內(nèi)lg Papp值隨pH的增大而增加，在pH 5.8～6.8時lg Papp值變化不明顯；虎杖苷在各溶液中的lg Papp值為1左右，白藜蘆醇在各溶液中的lg Papp值均大于2；大黃素在各溶液中的lg Papp值小于1.5。

3 討論

胃腸道不同部位具有不同的pH，如胃的pH為1.0～3.0，十二指腸的pH為4.0～6.0，空腸的pH為6.0～7.0，回腸的pH為7.0，結(jié)腸的pH為 8.0［12］。本研究所設(shè)計的緩沖溶液pH涵蓋了胃腸道的所有pH范圍，因而可模擬體內(nèi)環(huán)境研究其理化性質(zhì)。從平衡溶解度結(jié)果可知，虎杖苷在pH 2.0與pH 6.8時具有較高的溶解度，可能是這兩個酸性條件不利于虎杖苷的水解而提高了其溶解度；同時也表明虎杖苷在胃腸道中有較好的溶解度，有利于吸收。白藜蘆醇在pH為6.8、大黃素在pH為6.5的磷酸鹽緩沖液中溶解度最大，表明這兩個化合物在空腸中的溶解度較大。從總的平衡溶解度測定結(jié)果來看，虎杖苷的溶解性大于白黎蘆醇，是由于白黎蘆醇為虎杖苷的苷元，因而脂溶性較虎杖苷強。大黃素在各緩沖溶液中的平衡溶解度均較小，表明大黃素具有較強的脂溶性；另外，大黃素為多羥基的蒽醌類化合物，具有一定的酸性，因而在強酸性溶液中不易成鹽而溶解度較低。

藥物油水分配系數(shù)的測定，可模擬其在生物體內(nèi)水相和生物相之間的分配情況，從而預(yù)測其在體內(nèi)不同部位的吸收性能。表觀油水分配系數(shù) （P）值較大或具有一定脂溶性的藥物，其生物膜滲透性較高，有利于體內(nèi)藥物的吸收［13］。藥物的lg P對于藥物在胃腸道吸收速度和程度有較大的影響，其最佳log P值在-1＜log P＜2，過低時（log＜-2）的化合物未能穿過脂質(zhì)膜；過高時 （log P＞3）則因脂溶性過強而很難從細胞另一側(cè)的膜釋放出來進入附近的血管或淋巴管［13］?；⒄溶盏挠退峙湎禂?shù)在0.84～1.01之間，lg Papp均大于0，可預(yù)測在此pH條件下虎杖苷在胃腸道各部位均有較好的吸收；白藜蘆醇的油水分配系數(shù)在2.34～2.89之間，lg Papp均大于2，可知白藜蘆醇的親脂性過強，進而預(yù)示其很難從細胞的另一側(cè)釋放出來而生物利用度較低，這與文獻報道其具有較低的生物利用度一致［14］；大黃素的油水分配系數(shù)在0.97～1.27之間，均小于2，可見大黃素在胃腸道有較大的吸收，與文獻報道相同［15］。

本實驗通過測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在不同pH磷酸鹽緩沖液中表觀油水分配系數(shù)及平衡溶解度，為預(yù)測這3種成分在胃腸道不同pH梯度的吸收情況提供參考，同時也可為虎杖的新劑型開發(fā)及虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考價值。

［1］ LanzilliG，Cottarelli A，Nicotera G，et al.Anti-inflammatory effect of resveratrol and polydatin by in vitro IL-17 modulation

［J］.Inflammation，2012，35（1）：240-248.

［2］ Xiao M，Zhu T，Zhang W，et a l.Emodin ameliorates LPS-induced acute lung injury，involving the inactivation of NF-κB in mice［J］.Int JMol Sci，2014，15（11）：19355-10368.

［3］ Mitani T，Harada N，TanimoriS，eta l.Resveratrol inhibitshypoxia-inducible factor-1α-mediated androgen receptor signaling and represses tumor progression in castration-resistant prostate cancer［J］.JNutr Sci Vitaminol，2014，60（4）：276-282.

［4］ Pooja T，Karunagaran D.Emodin suppressesWnt signaling in human colorectal cancer cells SW480 and SW620［J］.Eur J Pharmacol，2014，742C：55-64.

［5］ Nabavi SF，Huige L，Daglia M，et al.Resveratrol and stroke：from chemistry tomedicine［J］.Curr Neurovasc Res，2014，11（4）：390-370.

［6］ 王 君，方 芳.虎杖苷在心腦血管系統(tǒng)的藥理研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（13）：2105-2107.

［7］ Zhang Q，Tan Y，Zhang N，et al.Polydatin supplementation ameliorates diet-induced development of insulin resistance and hepatic steatosis in rats［J］.Mol Med Rep，2014，2708.

［8］ 呂春艷，張?zhí)m桐，袁志芳，等.虎杖苷在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特點和組織分布研究［J］.中草藥，2007（2）：235-238.

［9］ 姚樹坤，蔣 曄，郝曉花，等.虎杖及其復(fù)方中大黃素在大鼠體內(nèi)的藥代學(xué)研究［J］.中國中藥雜志，2005（6）：463-465.

［10］ 葉肖栗，宋 莉，任國飛，等.HPLC-MS法測定虎杖活性成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)［J］.藥物分析雜志，2013，05（31）：749-754.

［11］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄111.

［12］ 張 煜，于樹宏，李 倩，等.RP-HPLC法同時測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的含量［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，30（10）：1049-1051.

［13］ 孫 進.現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)叢書：口服藥物吸收與轉(zhuǎn)運［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.

［14］ Wenzel E，Somoza V.Metabolism and bioavailability of transresveratrol［J］.Mol Nutr Food Res，2005，49（5）：472-481.

［15］ 彭 娟.虎杖藥材質(zhì)量及其大鼠藥代動力學(xué)與肝臟分布的研究［D］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2007.

Determ ination of equilibrium solubility and n-octanol/water partition coefficient of polydatin，resveratrol and emodin by HPLC-DAD

YAN Jian-ye1， WANG Yuan-qing2， HUANG Dan3， HAN Bin4*， ZHANG Chen5， XIANG Rong2，SUN Qin2， XIA Xin-hua1*

（1.Key Lab for Modernization of Materia Medica，Schoolof Pharmacy，Hunan University of ChineseMedicine，Changsha 41O2O8，China；2.Lab of Biotechnology and Engineering，College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 41OOO4，China；3. Province&State Key Laboratory Breeding Base for Chinese Powdered Medicineand Medicine Innovation in Hunan，Hunan University of ChineseMedicine，Changsha，41OO28，China；4.Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou，51OOO6，China；5.Graduate Studentof Classof2O14，School of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou，51O632，China）

AIM To determine the equilibrium solubility of polydatin，resveratrol and emodin in different solvents and their n-octanol/water partition coefficients.METHODS The equilibrium solubilities of polydatin，resveratrol and emodin in solutionswere determined through HPLC-DAD analysis，and their n-octanol/water partition coefficients weremeasured by shaking flask combined with HPLC-DAD.RESULTS The equilibrium solubilities of polydatin and resveratrolwere found in theirmaximal values at pH 6.8，while that of emodin was at pH 6.5.the

polydatin；resveratrol；emodin；equilibrium solubility；n-octanol/water partition coefficient；HPLC-DAD

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2628-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.012

2015-03-16

國家自然科學(xué)基金面上項目 （81173194）；湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心項目資助 （湘科計字 ［2013］83號）；湖南省高校 “中藥新藥創(chuàng)制與資源綜合持續(xù)利用”科技創(chuàng)新團隊資助 （湘教通 ［2010］212號）；湖南省 “中藥學(xué)”重點學(xué)科資助（ZY201401）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目 （201410538015）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實驗計劃項目 （2014194）；中南林業(yè)科技大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實驗計劃項目 （201457）

嚴建業(yè) （1975—），男，博士，副教授，從事中藥藥劑的教學(xué)與科研。Tel：（0731）88458231，E-mail：yanjianye201@ 126.com

*通信作者：韓 彬，男，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：（0731）39352182，E-mail：hblz99@2lcn.com夏新華，男，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：（0731）88458227，E-mail：xiaxinhua001@163.com

scopes of n-octanol/water partition coefficients of polydatin，resveratrol and emodin in different pH buffer solutions were within the ranges of 0.84-1.01，2.34-2.89，and 0.97-1.27，respectively.And their lg Pappin n-octanol/water solventwere shown to be 0.98，2.69，and 0.99，respectively.CONCLUSION Unlike resveratrol，polydatin and emodin have good absorption under physiological conditions in the gastrointestines.