• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)與K-B紙片擴(kuò)散法在腸桿菌科細(xì)菌中對(duì)阿米卡星藥敏結(jié)果差異的探討

    2015-12-07 09:22:44牛冬梅周萬青
    東南國防醫(yī)藥 2015年2期
    關(guān)鍵詞:糖苷紙片氨基

    牛冬梅,周萬青,洪 駿,陳 云

    氨基糖苷類抗生素作為一類高效、廣譜的抗生素,由于該類抗菌藥物的過度使用,使得臨床分離株的耐藥率呈逐年上升趨勢[1]。細(xì)菌對(duì)該類藥物耐藥主要通過產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶以及整合子攜帶相關(guān)基因等途徑[2-4]。氨基糖苷類藥物中抗菌譜較寬的阿米卡星(AMK)在臨床上應(yīng)用較為廣泛。然而在K-B紙片擴(kuò)散法藥敏檢測試驗(yàn)中,革蘭陰性桿菌對(duì)AMK耐藥表型可表現(xiàn)為單純的耐藥表型和誘導(dǎo)耐藥表型[5]。對(duì)于導(dǎo)致AMK雙圈(double zone,DZ)耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)耐藥機(jī)制研究已有報(bào)道[5-7],也進(jìn)行了一些探討[8-9]。目前一些自動(dòng)化的微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)已得到了廣泛應(yīng)用,應(yīng)用較為廣泛的自動(dòng)化鑒定及藥敏系統(tǒng)主要有Vitek、Phoenix和MicroScan三種。為評(píng)估以上藥敏系統(tǒng)對(duì)在K-B紙片擴(kuò)散法中對(duì)AMK呈雙圈耐藥的腸桿菌科細(xì)菌藥敏試驗(yàn)情況及相關(guān)耐藥機(jī)制,我們進(jìn)行了以下試驗(yàn)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株來源 2011年11月-2013年09月間從南京鼓樓醫(yī)院分離的K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)AMK呈雙圈耐藥的大腸埃希菌 8株(編號(hào) Eco35、Eco85、Eco110、Eco122、Eco126、Eco174、Eco235、Eco290)、肺炎克雷伯菌4株(編號(hào) Kpn94、Kpn110、Kpn113、Kpn201)和產(chǎn)氣腸桿菌1株(E112),分別分離自尿液6例,分泌物4例、膽汁2例和引流液1例。同期分離的AMK完全耐藥和敏感的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌各兩株作為對(duì)照菌株。菌株經(jīng)Vitek 2 Compact鑒定卡(法國梅里埃公司產(chǎn)品)鑒定。ATCC Escherichia coli 25922、ATCC Pseudomonas aeruginosa 27853作為質(zhì)控菌株,

    1.2 儀器及試劑 Taq DNA聚合酶、10×buffer(含Mg2+)、dNTPs(TaKaRa公司);DNA marker(美國Ferments公司);AMK藥敏紙片(英國Oxoid公司)、AMK粉劑(中國藥品生物制品檢定所);Vitek 2 Compact及配套AST-GN13藥敏卡(法國生物梅里埃公司);Phoenix-100及配套NMIC/ID4藥敏卡(美國BD公司);MicroScan AS-4及配套藥敏NC50卡(西門子公司);蛋白酶K(德國Merck公司);PCR擴(kuò)增儀(美國PE公司);生物電泳圖像分析系統(tǒng)及Smart View分析軟件(上海復(fù)日公司)。

    1.3 藥敏試驗(yàn) 自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)試驗(yàn):分別按Vitek 2 Compact、Phoenix和MicroScan儀器操作要求及配套的藥敏卡檢測最低抑菌濃度(MIC);K-B紙片擴(kuò)散法及瓊脂稀釋法操作參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2013年標(biāo)準(zhǔn)。MIC結(jié)果判斷依據(jù)CLSI規(guī)定的腸桿菌科細(xì)菌AMK藥敏折點(diǎn):MIC≥64 mg/L為耐藥(R)、32 mg/L為中介(I)、≤16 mg/L為敏感(S)。

    1.4 細(xì)菌DNA提取 挑取純培養(yǎng)菌落置于0.5 mL離心管內(nèi)(內(nèi)預(yù)置200 ng/mL蛋白酶K溶液200 μL),56 ℃水浴2 h,改 95 ℃水浴10 min,13 000 g離心30 s。上清液即為基因檢測的模板液,置-20℃冰箱備用。

    1.5 耐藥相關(guān)基因PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[2-4]分別合成氨基糖苷類修飾酶基因、Ⅰ~Ⅲ類整合酶基因及整合子可變區(qū)以及16S rRNA甲基化酶基因擴(kuò)增引物,序列見表1,由上海英駿公司合成??偡磻?yīng)體系為50 μL,其中10 × buffer(含 Mg2+)5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)各 4 μL,DNA 模板 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各 2 μL,Taq DNA 酶 0.3 μL,ddH2O 34.7 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5 min;94℃30 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 50 s,共 30 個(gè)循環(huán);最后延伸72℃ 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察。將PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送上海美吉公司測序,結(jié)果在Genbank上比對(duì)。

    表1 靶基因PCR引物序列及產(chǎn)物大小

    2 結(jié)果

    2.1 藥敏結(jié)果 13株雙圈表型腸桿菌科細(xì)菌對(duì)常規(guī)藥物呈現(xiàn)出多重耐藥性,僅對(duì)亞胺培南、厄他培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦較為敏感,敏感率在75%以上,對(duì)其他檢測藥物的耐藥率均在50%以上。藥敏結(jié)果見表2。K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)顯示所測13株菌株對(duì)AMK均呈現(xiàn)雙圈耐藥表型;瓊脂稀釋法結(jié)果顯示,13株雙圈表型菌株與4株完全耐藥對(duì)照菌株對(duì) AMK均耐藥,MIC值均 >512 mg/L,4株敏感菌株對(duì)AMK均敏感,MIC值均≤2 mg/L。見表3。

    三種自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)對(duì)于敏感及完全耐藥菌株的藥物敏感性結(jié)果與K-B紙片擴(kuò)散法相符。而對(duì)于雙圈表型菌株,Phoenix和MicroScan藥敏系統(tǒng)結(jié)果均為耐藥;而Vitek 2 Compact藥敏卡出現(xiàn)不同結(jié)果,其中4株菌株為敏感,4株為中介,5株為耐藥。見表3。

    2.2 PCR檢測結(jié)果 13株雙圈菌株和8株對(duì)照菌株中17株菌株檢出不同的氨基糖苷類修飾酶基因,其中單獨(dú)攜帶 aac(6’)-Ⅰ基因 10株;Eco126、Kpn94和 Eco1113 同 時(shí) 檢 出 aac(6’)-Ⅰ和 ant(2")-I基因;Eco174和Kpn201同時(shí)檢出aac(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ;Kpn110 檢出 ant(3")-Ⅰ基因;E112 檢出aac(3)-Ⅱ基因;其余4株菌株均未檢出以上6種氨基糖苷類修飾酶基因。

    表2 13株對(duì)AMK雙圈耐藥的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)17種抗菌藥物的耐藥性(株)

    表3 雙圈耐藥和對(duì)照菌株藥敏結(jié)果及相關(guān)基因檢測結(jié)果

    13株雙圈菌株和8株對(duì)照菌株中18株擴(kuò)增出Ⅰ類整合酶基因,其中15株攜帶可變區(qū)基因盒。攜帶基因盒為aadA5-dfra17(1.6 kb)菌株8株,攜帶基因盒為aadA2-dfrA12(1.8 kb)3株,攜帶基因盒dfrA12-orfF-aadA2(2.0 kb)2株,未檢出Ⅱ類、Ⅲ類整合酶基因。13株雙圈耐藥表型菌株均擴(kuò)增出armA甲基化酶基因,測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)基因突變,未檢出rmtB基因;而8株對(duì)照菌株均未擴(kuò)增出armA、rmtB基因。結(jié)果見表3。

    3 討論

    雙圈耐藥表型菌株和完全耐藥、敏感對(duì)照菌株大多檢出1種以上氨基糖苷類修飾酶基因,其中aac(6’)-Ⅰ和aac(3)-Ⅱ基因的檢出率較高,這與國內(nèi)的調(diào)查大體一致[10]。aac(6’)-Ⅰ基因是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的重要修飾酶基因,可修飾妥布霉素、奈替米星、卡那霉素和阿米卡星。aac(3)-Ⅱ可使細(xì)菌對(duì)妥布霉素、奈替米星及慶大霉素耐藥。本實(shí)驗(yàn)中4株AMK敏感細(xì)菌均檢出aac(6’)-Ⅰ基因,但菌株卻對(duì)AMK敏感,這可能與菌株耐藥基因表達(dá)量少致體外表型試驗(yàn)尚不能檢測出有關(guān)[11]。研究顯示,由于氨基糖苷類修飾酶基因的多樣性,雖然耐藥菌株攜帶不同的氨基糖苷類修飾酶基因,但卻與耐藥表型不具一致性,這可能與氨基糖苷類藥物耐藥的其他相關(guān)機(jī)制有關(guān)[12]。

    整合子是一系列遺傳元件構(gòu)成的能夠識(shí)別和捕獲移動(dòng)性基因盒的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng),是細(xì)菌尤其是革蘭陰性菌多重耐藥迅速傳播的重要原因[13]。13株雙圈耐藥菌株和8株對(duì)照菌株中18株擴(kuò)增出Ⅰ類整合酶基因,其中15株攜帶基因盒。可變區(qū)攜帶基因盒分別為 aadA5-dfra17、aadA2-dfrA12和dfrA12-orfF-aadA2三種。dfrA12和dfrA17造成菌株對(duì)甲氧芐啶耐藥,而aadA2和aadA5則造成菌株對(duì)鏈霉素和壯觀霉素耐藥,并不造成對(duì)AMK耐藥[4]。另據(jù)張躍進(jìn)等[14]對(duì)肺炎克雷伯菌中攜帶的整合子基因盒調(diào)查發(fā)現(xiàn),aadA5-dfrA17基因盒最為多見。

    16S rRNA甲基化酶可造成菌株對(duì)氨基糖苷類藥物的高水平耐藥(>512 mg/L),而armA基因則是最常見的一種甲基化酶[3]。本文雙圈耐藥菌株均檢出armA基因,而完全耐藥菌株和敏感菌株均未檢出。由此推測,AMK雙圈耐藥表型的出現(xiàn)與16S rRNA甲基化酶armA基因的表達(dá)相關(guān)。Jung等 研究發(fā)現(xiàn),鮑曼不動(dòng)桿菌AMK DZ耐藥表型與armA基因表達(dá)相關(guān),同時(shí)外排機(jī)制也發(fā)揮著重要作用。在腸桿菌科細(xì)菌AMK DZ耐藥表型中是否與外排機(jī)制相關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

    對(duì)于雙圈耐藥表型,用自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)檢測結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的偏倚[7-8]。我們所檢測的13株K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)AMK呈DZ耐藥表型的腸桿菌科細(xì)菌中,瓊脂稀釋法結(jié)果均為耐藥;三種自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)中的Phoenix和MicroScan兩種系統(tǒng)均為耐藥,而Vitek 2 Compact鑒定系統(tǒng)結(jié)果4株菌株為敏感,4株為中介,5株為耐藥。Vitek 2 Compact藥敏卡ASTGN-13的使用說明中指出其使用限制:鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)AMK的MIC值為8或16mg/L時(shí),需用其他藥敏方法確認(rèn),尤其對(duì)于多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌[15-16],而對(duì)腸桿菌科細(xì)菌并未有特別說明。對(duì)于氨基糖苷類藥物在自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)中檢測的準(zhǔn)確性也有文獻(xiàn)報(bào)道[7,15-16]。在檢測鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)AMK的敏感性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),自動(dòng)化儀器出現(xiàn)敏感結(jié)果而紙片擴(kuò)散法結(jié)果卻為耐藥[12,16]。其中 Phoenix和MicroScan兩種自動(dòng)化儀器的結(jié)果比Vitek2結(jié)果更加接近于實(shí)際的MIC結(jié)果[16]。紙片擴(kuò)散法和E-test方法在這類藥物敏感性的檢測上具有明顯的優(yōu)越性,而且這種錯(cuò)誤的產(chǎn)生與是否產(chǎn)特異性氨基糖苷類修飾酶基因不具相關(guān)性[16]。

    準(zhǔn)確的菌株藥敏試驗(yàn)對(duì)于感染的治療至關(guān)重要,尤其對(duì)于目前細(xì)菌耐藥性逐漸升高的狀況[17-19]。目前絕大多數(shù)的現(xiàn)代化微生物實(shí)驗(yàn)室很大程度上依賴自動(dòng)化的微生物鑒定藥敏系統(tǒng)。然而,自動(dòng)化藥敏系統(tǒng)有時(shí)卻產(chǎn)生差錯(cuò)[12,15-16,20-23]。Vitek 2 Compact自動(dòng)化微生物系統(tǒng)在檢測腸桿菌科細(xì)菌AMK敏感性時(shí)可能出現(xiàn)假敏感,避免這種差錯(cuò)的簡便方法就是用K-B紙片擴(kuò)散法復(fù)檢。

    [1] Vakulenko SB,Mobashery S.Versatility of aminoglycosides and prospects for their future[J].Clin Microbiol Rev,2003,16(3):430-450.

    [2] 段建春,呂曉菊.革蘭氏陰性菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國抗生素雜志,2004,29(6):329-331.

    [3] 吳 瓊,倪語星.一種新的氨基糖苷類耐藥決定因子:質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA 甲基化酶[J].微生物與感染,2009,4(1):45-48.

    [4] 陳 輝,李 翔,伍 勇,等.革蘭陰性菌中整合子攜帶氨基糖苷類耐藥基因的分布[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2009,27(4):248-251.

    [5] 鄧進(jìn)進(jìn),邵海楓,王衛(wèi)萍,等.鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物雙圈耐藥現(xiàn)象的初步探討[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2008,26(2):90-92.

    [6] 張曉文,邵海楓,王衛(wèi)萍,等.導(dǎo)致氨基糖苷類藥物雙圈耐藥型鮑曼不動(dòng)桿菌的相關(guān)攜帶基因研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2011,29(1):19-21.

    [7] Jung S,Yu JK,Shin SH,et al.False susceptibility to amikacin by VITEK 2 in acinetobacter baumannii harboring armA[J].Ann Clin Lab Sci,2010,40(2):167-171.

    [8] 周萬青,沈 瀚,寧明哲,等.腸桿菌科細(xì)菌對(duì)阿米卡星雙圈耐藥機(jī)制探討[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2013,31(7):490-493.

    [9] 周萬青,沈 瀚,寧明哲,等.導(dǎo)致阿米卡星雙圈耐藥腸桿菌科細(xì)菌耐藥性研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,28(11):1012-1015.

    [10]周 軍,史偉峰,糜祖煌.肺炎克雷伯菌β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶、氯已啶-磺胺耐藥基因研究[J].中國抗生素雜志,2007,32(10):627-630.

    [11]黃支密,糜祖煌,儲(chǔ)秋菊,等.肺炎克雷伯菌臨床分離株中出現(xiàn)16S rRNA甲基化酶基因rmtB[J].中華流行病學(xué)雜志,2008,29(9):909-914.

    [12] Akers KS,Chaney C,Barsoumian A,et al.Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in acinetobacter baumanniicalcoaceticus complex[J].J Clin Microbiol,2010,48(4):1132-1138.

    [13] Labbate M,Case,RJ,Stokes HW.The integron/gene cassstte system:an active player in bacterial adaptation[J].MethodsMol Biol,2009,532:103-125.

    [14]張躍進(jìn),常清利,汪 倩,等.臨床分離肺炎克雷伯菌I類整合子的結(jié)構(gòu)與功能[J].遺傳,2014,36(6):603-610.

    [15] Gilad J,Giladi M,Poch F,et al.“All-in-one-plate”E-test and disk diffusion susceptibility co-testing for multiresistant Acinetobacter baumannii[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2006,25:799-802.

    [16] Gilad J,Schwartz D.Need for verification of imipenem(IPM),meropenem(MER)and amikacin(AK)VITEK-2 susceptibility results for Acinetobacter baumannii(Ab)[C]48th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy.Washington,DC,2008:Abstract D-284.

    [17]楊 燕,孫長貴,陳 堅(jiān),等.用改良Hodge試驗(yàn)檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌[J].東南國防醫(yī)藥,2011,13(3):223-225.

    [18]石曉卉,劉 琪,于湘友.外科重癥監(jiān)護(hù)室臨床細(xì)菌分布及耐藥性監(jiān)測[J].東南國防醫(yī)藥,2014,16(4):349-352.

    [19]馮俊明,肖光夏,夏培元,等.燒傷創(chuàng)面的細(xì)菌分離及其耐藥性的初步分析[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志,2011,25(1):32-34.

    [20] Stone ND,O’Hara CM,Williams PP,et al.Comparison of disk diffusion,Vitek 2,and broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for unusual species of Enterobacteriaceae[J].J Clin Microbiol,2007,45(2):340-346.

    [21] Jang W,Park YJ,Park KG,et al.Evaluation of MicroScan Walk-Away and Vitek 2 for determination of the susceptibility of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates to cefepime,cefotaxime and ceftazidime[J].J Antimicrob Chemother,2013,68(10):2282-2285.

    [22] Lee SY,Shin JH,Lee K,et al.Comparison of the Vitek 2,MicroScan,and Etest methods with the agar dilution method in assessing colistin susceptibility of bloodstream isolates of Acinetobacter species from a Korean university hospital[J].J Clin Microbiol,2013,51(6):1924-1926.

    [23] Sader HS,F(xiàn)ritsche TR,Jones RN.Accuracy of three automated systems(MicroScan WalkAway,VITEK,and VITEK 2)for susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa against five broad-spectrum beta-lactam agents[J].J Clin Microbiol,2006,44(3):1101-1104.

    猜你喜歡
    糖苷紙片氨基
    放紙片
    豬δ冠狀病毒氨基肽酶N的研究進(jìn)展
    聽話的紙片
    童話世界(2020年26期)2020-10-27 02:23:30
    討厭體假日
    甜葉菊及其糖苷的研究與發(fā)展探索
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:47
    利用烷基糖苷遷移和擴(kuò)張共軛亞油酸囊泡pH窗口
    相轉(zhuǎn)移催化合成2-氨基異煙酸
    紙片里的“歡聲笑語”
    固體超強(qiáng)酸催化合成丁基糖苷
    2-(N-甲氧基)亞氨基-2-苯基乙酸異松蒎酯的合成及表征
    国产高清视频在线观看网站| 最好的美女福利视频网| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲av一区综合| 精华霜和精华液先用哪个| 麻豆成人av在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 久久九九热精品免费| 欧美精品国产亚洲| 最好的美女福利视频网| 亚洲无线观看免费| 成人鲁丝片一二三区免费| 尾随美女入室| 亚洲欧美精品综合久久99| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩av在线大香蕉| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产免费男女视频| 乱人视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 我的女老师完整版在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 禁无遮挡网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 色综合色国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日本 欧美在线| 亚洲四区av| 国产精品永久免费网站| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 国产伦精品一区二区三区四那| 黄色日韩在线| 热99在线观看视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 成年免费大片在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产午夜福利久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产不卡一卡二| 免费观看人在逋| 国产成人av教育| 国内精品久久久久精免费| 99视频精品全部免费 在线| 欧美bdsm另类| 亚洲精品影视一区二区三区av| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 两个人的视频大全免费| 亚洲18禁久久av| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲在线自拍视频| 亚洲中文字幕日韩| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久人妻av系列| 波野结衣二区三区在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 性欧美人与动物交配| 中文资源天堂在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美中文日本在线观看视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一a级毛片在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 美女高潮的动态| 18+在线观看网站| 嫩草影视91久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲av不卡在线观看| 又爽又黄a免费视频| 欧美+日韩+精品| 国产精品综合久久久久久久免费| АⅤ资源中文在线天堂| 禁无遮挡网站| 99精品在免费线老司机午夜| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲av成人av| 久99久视频精品免费| av在线老鸭窝| 免费在线观看影片大全网站| 精品久久国产蜜桃| 国产淫片久久久久久久久| 国产综合懂色| 永久网站在线| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩亚洲欧美综合| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人国产一区最新在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜福利在线在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 熟女人妻精品中文字幕| 日日夜夜操网爽| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 动漫黄色视频在线观看| 国产精品一及| 乱系列少妇在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久精品影院6| 国内精品宾馆在线| 天堂网av新在线| 不卡一级毛片| or卡值多少钱| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久国产成人精品二区| 精品久久久久久成人av| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 三级毛片av免费| 在线播放无遮挡| 日本色播在线视频| 欧美zozozo另类| 欧美国产日韩亚洲一区| 女同久久另类99精品国产91| 变态另类丝袜制服| 午夜激情欧美在线| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲精品一区av在线观看| 我要搜黄色片| 国产精品永久免费网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲欧美日韩高清专用| 99久久精品一区二区三区| 男人舔奶头视频| 欧美性感艳星| 国产av一区在线观看免费| 在线天堂最新版资源| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人aa在线观看| 亚洲午夜理论影院| 深夜a级毛片| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲人成网站在线播| 波野结衣二区三区在线| 精品午夜福利在线看| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久久久久久成人| avwww免费| 久久久久国内视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 五月伊人婷婷丁香| 欧美成人一区二区免费高清观看| 看片在线看免费视频| 国产av在哪里看| 日日干狠狠操夜夜爽| av黄色大香蕉| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品一区二区免费欧美| 午夜免费成人在线视频| 久久6这里有精品| 在线播放国产精品三级| 我的老师免费观看完整版| a级毛片a级免费在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产极品精品免费视频能看的| 国产成人福利小说| 干丝袜人妻中文字幕| 免费av不卡在线播放| 欧美精品国产亚洲| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲av免费在线观看| bbb黄色大片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 黄色女人牲交| 51国产日韩欧美| 亚洲最大成人中文| 国产91精品成人一区二区三区| 久99久视频精品免费| 特级一级黄色大片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 18+在线观看网站| 最新中文字幕久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 欧美激情国产日韩精品一区| 波多野结衣高清作品| 国内精品久久久久久久电影| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人福利小说| 亚洲av不卡在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲人成网站在线播| 身体一侧抽搐| 色播亚洲综合网| 日本一本二区三区精品| 国产精品福利在线免费观看| 日本欧美国产在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 淫妇啪啪啪对白视频| 97碰自拍视频| 99riav亚洲国产免费| 赤兔流量卡办理| eeuss影院久久| 99久久精品国产国产毛片| 午夜日韩欧美国产| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久色成人| 99久久九九国产精品国产免费| 波多野结衣高清作品| 成人二区视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 我要搜黄色片| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产精品合色在线| 国产亚洲91精品色在线| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩黄片免| 在线观看美女被高潮喷水网站| 色尼玛亚洲综合影院| 成人毛片a级毛片在线播放| 一夜夜www| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产av在哪里看| a在线观看视频网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 黄色视频,在线免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美成人a在线观看| av专区在线播放| 亚洲美女视频黄频| 三级毛片av免费| 日本成人三级电影网站| 舔av片在线| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜福利在线在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线免费观看不下载黄p国产 | 日本欧美国产在线视频| 黄色一级大片看看| 成年女人永久免费观看视频| 级片在线观看| 成人国产麻豆网| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 网址你懂的国产日韩在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品永久免费网站| 久久人人精品亚洲av| 在现免费观看毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲av一区综合| 黄色欧美视频在线观看| avwww免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 日本a在线网址| 日韩一区二区视频免费看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 51国产日韩欧美| 中文亚洲av片在线观看爽| 俄罗斯特黄特色一大片| 淫妇啪啪啪对白视频| 一a级毛片在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲中文字幕日韩| 91久久精品国产一区二区成人| 99久久精品一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲三级黄色毛片| 久久99热这里只有精品18| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜福利高清视频| 性色avwww在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 露出奶头的视频| 国产精品一区二区免费欧美| 精品一区二区免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产av在哪里看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 观看美女的网站| 成人一区二区视频在线观看| 88av欧美| 国产 一区 欧美 日韩| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线免费十八禁| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 天美传媒精品一区二区| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 99热网站在线观看| 婷婷丁香在线五月| 久久人人精品亚洲av| 国产美女午夜福利| 国产精品一区二区性色av| 精品久久久久久久末码| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 嫩草影院精品99| 成人一区二区视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本五十路高清| 亚洲国产色片| 久久精品91蜜桃| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产毛片a区久久久久| 露出奶头的视频| 免费在线观看日本一区| 久久中文看片网| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 久久午夜福利片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 乱人视频在线观看| 中文字幕高清在线视频| 国产av不卡久久| 九色国产91popny在线| 少妇丰满av| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲 国产 在线| 久9热在线精品视频| 一区二区三区激情视频| 国产精品久久视频播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美日本视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99热精品在线国产| 长腿黑丝高跟| 黄色欧美视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 老司机福利观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产爱豆传媒在线观看| 成人午夜高清在线视频| 亚洲三级黄色毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 婷婷丁香在线五月| 免费在线观看影片大全网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产一区二区三区视频了| 日本一二三区视频观看| 在线天堂最新版资源| 欧美成人一区二区免费高清观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲va在线va天堂va国产| av福利片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美三级亚洲精品| 久久久色成人| 中文字幕av成人在线电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 我的老师免费观看完整版| 在现免费观看毛片| 国产高潮美女av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产淫片久久久久久久久| 1000部很黄的大片| 99精品久久久久人妻精品| av在线蜜桃| 好男人在线观看高清免费视频| 国产午夜福利久久久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| av女优亚洲男人天堂| 两个人的视频大全免费| 国产精品一区www在线观看 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲美女视频黄频| 国产大屁股一区二区在线视频| 丰满的人妻完整版| 一本精品99久久精品77| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 免费av观看视频| 舔av片在线| 亚洲无线观看免费| а√天堂www在线а√下载| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人午夜高清在线视频| 波野结衣二区三区在线| 午夜免费激情av| 欧美三级亚洲精品| 成人av在线播放网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品456在线播放app | 精品久久久噜噜| 久久精品影院6| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产在线男女| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久亚洲真实| 999久久久精品免费观看国产| 日韩亚洲欧美综合| 男人舔奶头视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产综合懂色| 国产黄a三级三级三级人| 麻豆一二三区av精品| 欧美性猛交黑人性爽| 在线国产一区二区在线| 欧美日韩乱码在线| 黄色一级大片看看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产极品精品免费视频能看的| 麻豆成人午夜福利视频| 此物有八面人人有两片| 美女高潮的动态| 国产不卡一卡二| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 伦精品一区二区三区| 日本爱情动作片www.在线观看 | 久久精品国产自在天天线| 直男gayav资源| 国产成年人精品一区二区| 免费人成在线观看视频色| 麻豆国产97在线/欧美| 成人精品一区二区免费| 日本a在线网址| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久国产成人免费| 亚洲 国产 在线| 干丝袜人妻中文字幕| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产大屁股一区二区在线视频| 天堂√8在线中文| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本爱情动作片www.在线观看 | 色吧在线观看| 成人精品一区二区免费| 日日干狠狠操夜夜爽| .国产精品久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品久久久久久精品电影| 国内精品久久久久精免费| 白带黄色成豆腐渣| 男人的好看免费观看在线视频| 两个人的视频大全免费| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲人成网站在线播| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 真实男女啪啪啪动态图| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久久久久久久久成人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲精品成人久久久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 有码 亚洲区| 尾随美女入室| 欧美黑人巨大hd| 亚洲第一区二区三区不卡| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产久久久一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 中文资源天堂在线| 97热精品久久久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 久久99热6这里只有精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成人综合一区亚洲| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品国产高清国产av| 禁无遮挡网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲国产欧美人成| 天天一区二区日本电影三级| 给我免费播放毛片高清在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品午夜福利在线看| 色5月婷婷丁香| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产91精品成人一区二区三区| 看黄色毛片网站| 夜夜爽天天搞| 久久热精品热| 99热这里只有精品一区| 床上黄色一级片| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲最大成人手机在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲在线观看片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 少妇高潮的动态图| 能在线免费观看的黄片| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 天美传媒精品一区二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产探花在线观看一区二区| av视频在线观看入口| 人妻夜夜爽99麻豆av| 极品教师在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 久久国内精品自在自线图片| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一级黄片播放器| 精品一区二区免费观看| 91在线观看av| 日韩高清综合在线| 日本五十路高清| 天堂影院成人在线观看| 深爱激情五月婷婷| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久99热6这里只有精品| 色吧在线观看| 久久久久久久久久成人| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 联通29元200g的流量卡| 日韩av在线大香蕉| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| a级毛片a级免费在线| 日本成人三级电影网站| 国产亚洲欧美98| 91麻豆精品激情在线观看国产| av在线亚洲专区| 99久久精品国产国产毛片| 91av网一区二区| 国内精品久久久久精免费| 一区二区三区四区激情视频 | 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久国产成人精品二区| 国产高清视频在线观看网站| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 热99在线观看视频| 国产精品不卡视频一区二区| 禁无遮挡网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 97热精品久久久久久| 最好的美女福利视频网| 精品久久久噜噜| 日韩av在线大香蕉| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产 一区 欧美 日韩| 国产伦人伦偷精品视频| 91久久精品电影网| 蜜桃久久精品国产亚洲av| or卡值多少钱| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美成人免费av一区二区三区| 免费高清视频大片| 亚洲av二区三区四区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 88av欧美| 白带黄色成豆腐渣| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品人妻久久久影院| 黄色一级大片看看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 在线播放无遮挡| 亚洲最大成人手机在线| 最新中文字幕久久久久| 欧美日本视频| 99在线视频只有这里精品首页| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美在线一区亚洲| 男人舔奶头视频| 亚洲av成人精品一区久久| 丝袜美腿在线中文| 亚洲真实伦在线观看| 中文字幕久久专区| 亚洲黑人精品在线| 亚洲精品一区av在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日本三级黄在线观看| 欧美性感艳星| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 99久久精品国产国产毛片| 少妇丰满av| av在线亚洲专区| 国产精品一区www在线观看 | 国产亚洲精品av在线| 麻豆国产av国片精品| 搡女人真爽免费视频火全软件 |