1例大劑量甲氨蝶呤治療骨肉瘤的藥代動(dòng)力學(xué)監(jiān)護(hù)

朱婷婷，趙宇蕾，齊謝敏，芮建中，周國華

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種抗代謝類抗腫瘤藥，屬細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于S期。MTX亦為葉酸拮抗劑，可與二氫葉酸還原酶(DHFR)的催化部位結(jié)合，由于其親和力很高，可用于抑制DHFR活性，阻止DHFR將二氫葉酸還原為四氫葉酸，使一碳單位轉(zhuǎn)移過程受到抑制，脫氧尿苷酸不能變?yōu)楹铣蒁NA所必需的脫氧胸苷酸，嘌呤核苷酸合成的早期階段也受抑制，使DNA及RNA合成均受阻。高濃度的MTX還可抑制葉酸進(jìn)入細(xì)胞，并促進(jìn)還原的葉酸外流，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)葉酸多聚谷氨酸池顯著縮小，競爭性地減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)的葉酸供應(yīng)。此外，MTX也可抑制胸腺核苷酸合成酶，抑制體液免疫和細(xì)胞免疫。大劑量MTX對(duì)多種惡性腫瘤療效顯著，如急性淋巴細(xì)胞白血病、骨肉瘤［1］、惡性淋巴瘤、頭頸部惡性腫瘤、非霍奇金淋巴瘤等。但MTX選擇性差，會(huì)帶來嚴(yán)重不良反應(yīng)，經(jīng)大劑量MTX化療后嚴(yán)重毒性反應(yīng)的發(fā)生率可達(dá)10%以上［2］，不同患者或同一患者的不同輪次治療時(shí)MTX血藥濃度亦存在較大差異，根據(jù)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果制定個(gè)體化治療方案，既可最大限度地避免化療產(chǎn)生的不良反應(yīng)，也能保證抗腫瘤的治療作用，降低復(fù)發(fā)率。

我院1例骨肉瘤經(jīng)大劑量MTX化療后出現(xiàn)血藥濃度異常，通過及時(shí)的血藥濃度測定和藥代動(dòng)力學(xué)監(jiān)護(hù)，為臨床救治提供了有效的技術(shù)支持，使患者恢復(fù)正常，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 患者男，15歲，未婚，身高180 cm，體重75 kg，體質(zhì)指數(shù)23.1 kg/m2。于外院行 MRI示:左股骨遠(yuǎn)端干骺端骨腫瘤。2014年2月24日在我院聯(lián)合腰麻下行“左股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤切開活檢術(shù)”，病理檢查示“左股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤”，高度侵襲性，腫瘤細(xì)胞侵犯骨外軟組織。4月7日因左股骨遠(yuǎn)端病理性骨折在同濟(jì)醫(yī)院行左大腿上段截肢術(shù)，術(shù)后恢復(fù)良好。

1.2 治療過程 患者于4月22日第三次入我院，體重63 kg，體質(zhì)指數(shù)19.4 kg/m2，肝腎功能正常。4月23日行MTX注射劑(MTX 10 g溶于0.9%氯化鈉500 mL內(nèi)靜脈滴注6 h)化療，并輔以長期甲酰四氫葉酸鈣(calcium folinate，CF)注射劑(25 mg/100 mL，4次/d，靜脈滴注)解毒，碳酸氫鈉注射劑(250 mL/d，靜脈滴注)堿化尿液，使入液量＞4000 mL，并囑其多飲水，使其尿量＞3000 mL，尿pH值≥6.5。同時(shí)采用復(fù)方甘草單銨 S注射劑(0.32 g，1次/d，靜脈滴注)保肝;核糖核酸注射劑、脫氧核苷酸鈉注射劑、磷酸肌酸鈉注射劑、復(fù)方三維B注射劑、能量合劑注射劑、門冬氨酸鳥氨酸注射劑、門冬酸鉀鎂注射劑、混合糖電解質(zhì)注射劑、轉(zhuǎn)化糖注射劑等維持營養(yǎng)、電解質(zhì)平衡;雷莫司瓊注射劑等用于止吐;托拉塞米注射劑、甘露聚糖肽注射劑、果糖注射劑用于利尿和改善微循環(huán);小牛脾提取物注射劑提高機(jī)體免疫力;泮托拉唑注射劑(80 mg，1次/d，靜脈滴注)抗酸抗?jié)儭?/p>

1.3 檢測儀器與試劑 MTX血藥濃度監(jiān)測儀(Syva Viva－E德國西門子公司)，甲氨蝶呤試劑盒(德國西門子公司)。PCR擴(kuò)增儀(A200 Grodient Thermal cycler中國 LongGene公司)，焦磷酸測序儀(Pyro－Mark Q24 MDx德國QIAGEN公司)，DNA提取試劑盒(美國Promega公司)，焦磷酸測序試劑盒(德國QIAGEN公司)。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合使用BAPP 3.1軟件自動(dòng)擬合處理，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.4 方法 靜脈滴注10 g MTX后采取靜脈血檢測24、48、72 h的MTX血藥濃度。以PCR法檢測亞甲基四氧葉酸還原酶(MTHFR)677C＞T基因型。留取外周全血樣本2 mL，按DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。實(shí)驗(yàn)用DNA模板均以紫外分光光度法測定其濃度及純度。PCR反應(yīng)體系包括 PCR－mix 43.5 μL［T－mix 12 μL(10 × PCR 緩沖液∶MgCl2∶dNTP Mixture=5∶3∶4)，蒸餾水 31.25 μL，rTaq 0.25μL］，引物(正反向)4 μL，引物(上海 Invitrogen公司合成)序列:上游引物:5’－GACTGTCATCCCTATTGGCAGGTT－3’，下游引物:5’－Biotin－CCCTCACCTGGATGGGAAAGA－3’。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10 min。取20 μL PCR產(chǎn)物加入 Binding Mix 60 μL(Sepharose Beads 2 μL，蒸餾水 18 μL，Binding Buffer 40 μL)，PyroMark Wash Buffer 24 μL，Denaturation Solution 1 μ，制備測序單鏈，加入測序引物退火，制備測序模板，測序引物序列:5’－GAGAAGGTGTCTGCGGGAG－3’。按焦磷酸測序試劑盒說明書操作進(jìn)行測序，測序引物后序列:5’－C/T CGATTT－3’［3］。

2 結(jié)果

2.1 患者 MTX血藥濃度－時(shí)間曲線 滴注10 g MTX后持續(xù)監(jiān)測該患者測得24、48、72 h點(diǎn)血藥濃度分 別 為 180.0 μmol/L、57.0 μmol/L、20.4 μmol/L，給藥后18 d內(nèi)MTX血藥濃度－時(shí)間曲線見圖1。

圖1 MTX血藥濃度－時(shí)間曲線圖

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 該患者滴注用藥后各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)BAPP 3.1自動(dòng)擬合后，藥物在體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程符合二室模型特征，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。

表1 患者10 g MTX滴注后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 MTHFR 677C＞T基因型 本例患者的MTHFR 677C＞T基因型為突變型(677TT)。

2.4 不良反應(yīng)及監(jiān)護(hù) 4月27日、28日患者出現(xiàn)嘔吐、腹脹反應(yīng)，29日出現(xiàn)厭食、惡心反應(yīng)，精神、食欲較差，口腔潰瘍嚴(yán)重，給予復(fù)方洗必泰漱口液(200 mL，漱口)、西瓜霜噴劑(2.5 g，外用)治療。4月29日，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶259 U/L↑，尿素12.4 mmol/L↑，肌酐254 μmol/L↑。5月3日，血小板計(jì)數(shù)93×109/L↓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)1.5×109/L↓，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)3.06×1012/L↓。5月6日，血小板計(jì)數(shù)22×109/L↓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)2.4×109/L↓，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)3.76×1012/L↓，予以粒細(xì)胞刺激因子注射劑(200 g，皮下注射，2次/d)提升白細(xì)胞，重組人白介素－11注射劑(1.5 mg，皮下注射，1次/d)提高血小板。5月8日，單采血小板1治療量，輕微過敏，靜推5 mg地塞米松。5月11日，血小板計(jì)數(shù)252×109/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)17.2 ×109/L↑，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)3.36 ×1012/L↓;肝腎功能無異常，血清MTX(即用藥后第18天)濃度為 0.15 μmol/L，CF解救停止。患者申請(qǐng)出院，囑患者注意休息，加強(qiáng)營養(yǎng)，定期化療。

3 討論

目前臨床較認(rèn)同大劑量MTX化療后中毒血藥濃度即過量毒性反應(yīng)上限為給藥后24 h＞10 μmol/L、48 h ＞1 μmol/L、72 h ＞ 0.1 μmol/L。本例患兒出現(xiàn)嚴(yán)重排泄延遲，用藥后72 h的MTX濃度為 20.4 μmol/L，t1/2β長達(dá) 58.8 h，藥師建議臨床醫(yī)生延長解救方案執(zhí)行時(shí)間，并持續(xù)為患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，跟蹤血藥濃度變化情況，用藥后第18天MTX血藥濃度達(dá)到臨床安全值(0.15 μmol/L)。

患者原計(jì)劃行吡柔比星、順鉑、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤的交替化療［4－5］。然而，MTX 化療后血藥濃度持續(xù)偏高，代謝緩慢，排泄延遲，肝腎功能受損，改行吡柔比星、順鉑、異環(huán)磷酰胺化療交替進(jìn)行，停用MTX，避免MTX造成嚴(yán)重的毒性損害。

MTHFR是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，國內(nèi)外研究MTX在人體內(nèi)的代謝與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系［6］，報(bào)道結(jié)果不一致，孟琳懿等［7］研究認(rèn) 為677CC型患兒可能出現(xiàn)更嚴(yán)重的藥物毒性反應(yīng)，說明攜帶677CC基因型的患兒對(duì)HD－MTX化療更敏感，但有報(bào)道與孟琳懿的結(jié)果相反，李天媛等［8］認(rèn)為突變型(677CT/TT)個(gè)體的MTX血藥濃度高、毒性反應(yīng)更大。導(dǎo)致MTX排泄延遲的危險(xiǎn)因素有MTX用量、開始化療后24 h內(nèi)尿常規(guī)pH值、個(gè)體基因型、肝腎功能等［9］。本例患者15歲，截肢術(shù)后體質(zhì)指數(shù)明顯降低，MTHFR 677C＞T基因型為突變型(TT)，而合用泮托拉唑注射劑(80 mg，1次/d，靜滴)，也可能增加血液中MTX濃度，增加不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)［10－11］。

水化、尿液堿化和葉酸解救等手段極大地降低了患者死亡率，但是HD－MTX導(dǎo)致的腎功能損害仍是嚴(yán)重問題，通過監(jiān)測MTX血藥濃度并根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整CF用量和次數(shù)已成臨床專家共識(shí)，近年來也有學(xué)者試圖從血液學(xué)、免疫學(xué)、常規(guī)生化的檢驗(yàn)來預(yù)判MTX蓄積中毒性事件，以制定合理有效的救援方案，但發(fā)現(xiàn)影響因素多且不確定，目前無法定論。眾多研究認(rèn)為，以48 h點(diǎn)血藥濃度對(duì)預(yù)測后期消除較為敏感，國內(nèi)多數(shù)兒童治療中心多以48 h MTX血藥濃度是否＞1 μmol/L來判斷排泄延遲或消除異常。患兒接受MTX后，對(duì)解救適宜與否直接關(guān)系療效與預(yù)后，若不能及時(shí)有效地進(jìn)行救援易發(fā)生黏膜損傷、急性肝腎功損傷甚至衰竭、嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)毒性等，但救援過度則會(huì)影響化療效果甚至加重原疾病復(fù)發(fā)。患者對(duì)MTX的耐受程度、重要臟器功能(尤其是腎功能)以及病理分期等均影響MTX在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄［12］，因而準(zhǔn)確的藥代動(dòng)力學(xué)監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)患者的嚴(yán)重不良反應(yīng)，對(duì)找出合理的MTX用量及CF解救時(shí)間、劑量，可及時(shí)為醫(yī)生合理用藥提供參考，為實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化給藥提供重要依據(jù)［13］。

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