雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株三磷酸腺苷含量以及新生血管生成的影響

鄧中華

（江西省吉安市中心人民醫(yī)院藥劑科，江西 吉安 343000）

·論著·

雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株三磷酸腺苷含量以及新生血管生成的影響

鄧中華

（江西省吉安市中心人民醫(yī)院藥劑科，江西 吉安 343000）

目的研究雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株三磷酸腺苷（ATP）以及新生血管生成的影響。方法培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株，分為空白對(duì)照組（不含胎牛血清和藥物的培養(yǎng)基處理）、順鉑組（10μmol/L順鉑處理）、雷帕霉素組（40 nmol/L雷帕霉素處理）、聯(lián)合用藥組（10μmol/L順鉑+40 nmol/L雷帕霉素處理），檢測(cè)細(xì)胞活力、ATP生成量以及上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）含量。結(jié)果順鉑組、雷帕霉素組和聯(lián)合用藥組的MTT值、ATP含量以及VEGF含量均低于空白對(duì)照組，且聯(lián)合用藥組的MTT值、ATP含量以及VEGF含量低于順鉑組和雷帕霉素組。結(jié)論雷帕霉素和順鉑能夠抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株ATP以及新生血管的生成，且兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同作用。

卵巢癌；雷帕霉素；順鉑；三磷酸腺苷；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

卵巢癌是一類對(duì)化療較為敏感的惡性腫瘤，臨床上多采用以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案來進(jìn)行治療。但是，仍有部分患者會(huì)在化療后出現(xiàn)耐藥或復(fù)發(fā)，這也是造成治療失敗以及預(yù)后不良的主要原因。mTOR是一類在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移等過程中發(fā)揮重要調(diào)控的分子，雷帕霉素是mTOR特異性的抑制劑，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)行為具有抑制作用，而這一惡性生物學(xué)行為又依賴于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）所提供的能量以及新生血管形成所提供的氧氣和能量物質(zhì)。本研究從ATP及新生血管生成的角度分析了雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株ATP以及新生血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1材料

卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株由中科院細(xì)胞庫(kù)提供；細(xì)胞培養(yǎng)用的DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清由Gbico公司提供，噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)試劑由Promega公司提供，ATP檢測(cè)試劑由碧云天公司提供；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒由上海邦奕公式提供，雷帕霉素及順鉑等藥物均由Cayman公司提供，常規(guī)耗材購(gòu)買于Nest生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法凍存在液氮罐中的細(xì)胞取出后復(fù)蘇，在15 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且鋪滿培養(yǎng)瓶底面70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，分別接種于培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中。培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用于繼續(xù)傳代，培養(yǎng)板中的細(xì)胞用于加藥處理。

1.2.2細(xì)胞處理方法當(dāng)培養(yǎng)板中的細(xì)胞鋪滿50%～60%時(shí)，用不含胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，使其生長(zhǎng)同步化，而后分別用不含F(xiàn)BS和藥物的培養(yǎng)基（空白對(duì)照組）、10μmol/L順鉑（順鉑組）、40 nmol/L雷帕霉素（雷帕霉素組）、10μmol/L順鉑+40 nmol/L雷帕霉素（聯(lián)合用藥組）處理。24 h后收集細(xì)胞上清液檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），收集細(xì)胞檢測(cè)MTT和ATP。

1.2.3MTT檢測(cè)采用promega公司的MTS試劑盒檢測(cè)MTT值，藥物處理24 h后直接在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入MTS檢測(cè)試劑200μl，在孵箱中孵育3～4 h，待檢測(cè)試劑變色后在酶標(biāo)儀上讀取490 nm處的吸光值作為MTT值，以空白對(duì)照組的MTT值為100，計(jì)算順鉑組、雷帕霉素組、聯(lián)合用藥組的MTT相對(duì)值。

1.2.4ATP檢測(cè)采用碧云天公司的ATP檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)S0026）檢測(cè)細(xì)胞中ATP的含量，同時(shí)采用BCA法測(cè)定同一細(xì)胞孔中細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量，計(jì)算每毫克細(xì)胞總蛋白中ATP的含量，并以此來反應(yīng)不同處理組間的ATP含量。

1.2.5VEGF檢測(cè)采用上海邦奕公式的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒VEGFA（DRE11354）、VEGFB（DRE10433）、VEGFC（DRE10430）檢測(cè)細(xì)胞上清液中VEGF不同亞型的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），組間分析采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05判斷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測(cè)結(jié)果

順鉑組、雷帕霉素組、聯(lián)合用藥組的MTT值分別為（42.5±8.4）、（45.2±7.2）和（19.4±4.7），均低于空白對(duì)照組的（100±17.3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組的MTT值低于順鉑組和雷帕霉素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同處理組SKOV-3細(xì)胞株的MTT檢測(cè)結(jié)果

2.2ATP檢測(cè)結(jié)果

順鉑組、雷帕霉素組、聯(lián)合用藥組的ATP含量分別為（73.2±11.1）、（69.5±9.5）和（25.4±4.6）nmol/mg，均低于空白對(duì)照組的（167.3±23.2）nmol/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組的ATP含量低于順鉑組和雷帕霉素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3VEGF檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)方差分析，4組間VEGF的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且順鉑組、雷帕霉素組和聯(lián)合用藥組的VEGFA、VEGFB及VEGFC含量低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合用藥組的VEGFA、VEGFB及VEGFC含量低于順鉑組和雷帕霉素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

圖2 不同處理組SKOV-3細(xì)胞株的ATP含量

附表4 組細(xì)胞上清液中VEGF含量比較（ng/mg±s）

附表4 組細(xì)胞上清液中VEGF含量比較（ng/mg±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）聯(lián)合用藥組與順鉑組和雷帕霉素組比較，P＜0.05

組別VEGFAVEGFBVEGFC空白對(duì)照組76.8±9.5169.2±30.1200.4±33.7順鉑組34.5±6.41）103.7±18.51）94.2±11.41）雷帕霉素組聯(lián)合用藥組40.8±7.11）19.3±2.81）2）110.4±16.21）48.2±7.51）2）104.5±15.91）39.4±6.51）2）F值26.2419.4924.25 P值0.0010.0010.001

3 討論

卵巢癌是生殖系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤，臨床上多采用順鉑為基礎(chǔ)的化療方案來處理卵巢癌，盡管卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑較為敏感，但耐藥和復(fù)發(fā)仍成為治療失敗的最重要原因[1]。因此，探尋不同作用靶點(diǎn)的藥物在卵巢癌的治療中具有現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值。mTOR由2549個(gè)氨基酸組成，屬于非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以整合能量代謝、氨基酸代謝、葡萄糖代謝以及生長(zhǎng)因子所激發(fā)的各種信號(hào)通路，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移等過程的調(diào)控，并且與cyclin D及c-myc等原癌基因的激活密切相關(guān)[3]。VAN DER BILT AR[4]的體外研究結(jié)果顯示，采用小RNA干擾的技術(shù)靶向抑制PI3K/AKT介導(dǎo)的mTOR信號(hào)通路不僅能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖過程，還能發(fā)揮強(qiáng)烈的抗血管新生作用。

近年來，越來越多的研究認(rèn)識(shí)到mTOR表達(dá)異常在惡性腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，張斌等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮癌組織中磷酸化mTOR的陽(yáng)性率高達(dá)53.9%，而在正常卵巢組織和良性卵巢上皮腫瘤組織中磷酸化mTOR均為陰性。HIRASAWA等[6]的體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，mTOR的過度激活會(huì)增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞株的惡性生物學(xué)行為，包括增殖、遷移以及侵襲。因此，抑制mTOR的激活也成為了治療卵巢癌最具前景的治療靶點(diǎn)。雷帕霉素的主要作用靶點(diǎn)是mTOR受體，屬于mTOR信號(hào)通路的拮抗劑[7]，能夠通過與FK506結(jié)合蛋白在空間上相互靠近并抑制下游蛋白S6K1、4E-BP1發(fā)生磷酸化，進(jìn)而抑制下游相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯，并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控[8]。

目前，國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于雷帕霉素處理卵巢癌細(xì)胞株的體外研究，國(guó)內(nèi)段釗[9]通過體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素聯(lián)合順鉑處理能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖并影響細(xì)胞周期，使細(xì)胞停滯于G1期而不進(jìn)入S期；國(guó)外SHEPPARD等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理可以抑制SKOV-3細(xì)胞的遷移和侵襲過程。本研究通過MTT法檢測(cè)卵巢癌SKOV-3株也同樣發(fā)現(xiàn)，順鉑和雷帕霉素處理均能抑制細(xì)胞增殖，且兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，順鉑聯(lián)合雷帕霉素處理組的MTT值顯著低于單藥處理組。這一結(jié)果反映出mTOR抑制劑雷帕霉素在抑制卵巢癌惡性生物學(xué)行為中的積極價(jià)值。

事實(shí)上，卵巢癌細(xì)胞無限增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為的完成主要依靠ATP所提供的能力以及新生血管所提供的氧氣和養(yǎng)分。惡性腫瘤細(xì)胞向周圍組織遷移和侵潤(rùn)是一個(gè)主動(dòng)的耗能過程，需要通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP提供能力，并在基質(zhì)金屬蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子的輔助下完成對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及向周圍組織的移行。腫瘤組織中大量新生血管可以為氧化磷酸化提供充足的氧氣以及葡萄糖等物質(zhì)，而在這一過程中，腫瘤瘤體分泌大量的細(xì)胞因子直接參與血管新生的過程，其中VEGF是目前為止已知作用最為明確的一類促血管新生細(xì)胞因子。通過檢測(cè)ATP和VEGF含量可知，順鉑和雷帕霉素處理均能抑制ATP和VEGF的產(chǎn)生，并且兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，順鉑聯(lián)合雷帕霉素處理組的ATP和VEGF含量均低于單藥處理組。

綜上所述，雷帕霉素和順鉑能夠抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株ATP以及新生血管的生成，且兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)具有協(xié)同作用。

[1]馬湘一,范良生,劉榮華,等.卵巢上皮性癌中mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)婦幼保健,2011,26(30):4755-4757.

[2]張晟,張霄蓓,張瑾,等.磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑在乳腺癌治療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)全科醫(yī)生,2012, 15(8C):2749-2754.

[3]韓璐,翟晶.雷帕霉素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和HIF-1及VEGF表達(dá)的影響[J].腫瘤防治研究,2013,40(3):245-248.

[4]VAN DER BILT AR,TERWISSCHA VAN SCHELTINGA AG, TIMMER-BOSSCHA H,et al.Measurement of tumor VEGF-A levels with 89Zr-bevacizumab PET as an early biomarker for the antiangiogenic effect of everolimus treatment in an ovarian cancer xenograft model[J].Clin Cancer Res,2012,18(22):6306-6014

[5]張斌,侯志勇,韋勵(lì),等.卵巢上皮癌組織中p-mTOR的表達(dá)及意義[J].中國(guó)婦幼保健,2012,27(5):737-740.

[6]HIRASAWA T,MIYAZAWA M,YASUDA M,et al.Alterations of hypoxia-induced factor signaling pathway due to mammalian target of rapamycin(mTOR)suppression in ovarian clear cell adenocarcinoma:in vivo and in vitro explorations for clinical trial [J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(7):1210-1218.

[7]劉奕,楊鳴良,張揚(yáng),等.哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白及其底物在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2004,22(4): 331-333.

[8]FENG X,LI L,JIANG H,et al.Dihydroartemisinin potentiates the anticancer effect of cisplatin via mTOR inhibition in cisplatin-resistant ovarian cancer cells:involvement of apoptosis and autophagy[J].BiochemBiophysResCommun,2014,444(3): 376-381.

[9]段釗,楊雪梅,邢蘭瑛,等.雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,31(4): 493-496.

[10]SHEPPARD KE,CULLINANE C,HANNAN KM,et al.Synergistic inhibition of ovarian cancer cell growth by combining selective PI3K/mTOR and RAS/ERK pathway inhibitors[J].Eur J Cancer,2013,49(18):3936-3944.

（王榮兵 編輯）

Effect of rapamycin combined with cisplatin on ATP production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line

Zhong-hua DENG
(Department of Pharmacy,the Central People's Hospital of Ji'an City,Ji'an, Jiangxi 343000,P.R.China)

【Objective】To study the effect of rapamycin combined with cisplatin on adenosine triphosphate(ATP) production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line.【Methods】Human ovarian cancer SKOV-3 cell line were cultured and divided into blank control group(treated with medium without FBS and drug),cisplatin group(treated with 10 μmol/L cisplatin),rapamycin group(treated with 40 nmol/L rapamycin),combination group (treated with 10 μmol/L cisplatin combined with 40 nmol/L rapamycin).Then cell viability,ATP production and vascular endothelial growth factor(VEGF)content in supernant were detected.【Results】MTT value,ATP content and VEGF content of cisplatin group,rapamycin group and combination group were lower than those of blank control group.MTT value,ATP content and VEGF content of combination group were lower than those of cisplatin group and rapamycin group.【Conclusion】Rapamycin and cisplatin can inhibite ATP production and angiogenesis in human ovarian cancer SKOV-3 cell line,and combined use of two drugs has a synergistic effect.

ovarian cancer;rapamycin;cisplatin;adenosine triphosphate;vascular endothelial growth factor

R737.31

A

1005-8982（2015）25-0034-04

2015-04-10