人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化過程中差異表達(dá)蛋白的鑒定和分析*

張愛霞，余偉華，王濤，馬保鋒

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物工程系，廣東 梅州 514015；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心，廣東 廣州 510080）

·論著·

人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化過程中差異表達(dá)蛋白的鑒定和分析*

張愛霞1，余偉華2，王濤1，馬保鋒2

（1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物工程系，廣東 梅州 514015；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心，廣東 廣州 510080）

目的探討人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）誘導(dǎo)成骨分化過程中的差異表達(dá)的蛋白點，為闡明hMSCs成骨分化的分子機(jī)制提供依據(jù)。方法收集hMSCs和成骨誘導(dǎo)7 d的細(xì)胞全蛋白，應(yīng)用雙向凝膠電泳和圖像分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)點的識別和檢測，應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)找出凝膠上的差異蛋白點,應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和生物信息學(xué)方法對差異蛋白點進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定和分析。結(jié)果通過MALDI-TOF-MS和生物信息學(xué)方法鑒定出了52種差異蛋白質(zhì)，其中13種蛋白質(zhì)在成骨誘導(dǎo)7 d后表達(dá)明顯上調(diào)，39種蛋白質(zhì)在成骨誘導(dǎo)7 d后表達(dá)明顯下調(diào)；利用Gene Ontology對這些蛋白質(zhì)按生物學(xué)過程和分子功能進(jìn)行了分析。結(jié)論鑒定了52種可能在hMSCs誘導(dǎo)成骨分化過程中發(fā)揮重要作用蛋白質(zhì)，這為進(jìn)一步揭示hMSCs成骨分化的分子機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；蛋白質(zhì)組學(xué)

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能[1]，研究表明MSCs在骨損傷的修復(fù)中起重要作用[2]。MSCs已成為重要的組織工程種子細(xì)胞，并且MSCs的細(xì)胞增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá)。因此，成為潛在細(xì)胞替代治療、基因治療的靶細(xì)胞。目前對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究也越來越深入，同時取得了很多可喜的成績。但是MSCs的成骨分化的確切機(jī)制尚未闡明。

本研究利用體外定向誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs）分化為成骨細(xì)胞的模型和蛋白組學(xué)技術(shù)，研究hMSCs分化為成骨細(xì)胞過程中成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，對于闡明MSCs分化為成骨細(xì)胞的分子機(jī)制具有重要意義，也將為臨床上治療骨質(zhì)疏松、難治性骨損傷等奠定初步的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑

hMSCs來自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程中心，L-DMEM培養(yǎng)基、H-DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco BRL公司，Vitamin C、地塞米松購自美國Sigma公司，β-甘油磷酸鈉購自美國Calbiochem公司，溴酚藍(lán)、十二烷基磺酸鈉、固相pH梯度膠條（pH 3～10，線性）、蛋白質(zhì)純化試劑盒及蛋白質(zhì)定量試劑盒等均購自瑞典Amersham Biosciences公司。

1.2儀器

倒置顯微鏡（IX71-22FL/PH，日本OLYMPUS公司），超凈工作臺（NU-301-630E，美國NUARIE公司），等電聚焦電泳系統(tǒng)（Ettan IPGphorⅡ，瑞典Amersham Biosciences公司）、垂直電泳系統(tǒng)（Ettan DALTsix，瑞典Amersham Biosciences公司）、掃描儀（Typhoon9400，瑞典Amersham Biosciences公司）、圖像分析軟件（Image MasterTM 2-D Platinum software 5.0，瑞典Amersham Biosciences公司）、全自動斑點處理工作站（Ettan Spot Handing Workstation，瑞典Amersham Biosciences公司）、基質(zhì)輔助激光解析離子飛行時間質(zhì)譜分析儀（Ettan MALDI-TOF Pro Mass Spectrometry，瑞典Amersham Biosciences公司）等。

1.3方法

1.3.1hMSCs體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及鑒定

將傳代擴(kuò)增后至第5代的hMSCs接種于六孔板，實驗組每孔加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（含10-7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/ml Vitamin C）2 ml；對照組每孔加入L-DMEM完全培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中。堿性磷酸酶染色：取成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化第10天的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，加入適量堿性磷酸酶染色液在室溫下孵育10～20 min，顯微鏡下觀察染色的結(jié)果。鈣結(jié)節(jié)染色：取上述誘導(dǎo)分化第18天的細(xì)胞，加入適量的茜素紅-S染色10～15 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2蛋白樣品的制備、雙向凝膠電泳及圖像分析加入裂解液裂解hMSCs及誘導(dǎo)成骨分化7 d的細(xì)胞，超聲波處理，20000 g，4℃離心30 min，取上清液。按蛋白質(zhì)純化試劑盒說明書方法純化蛋白后，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒，按照說明書方法，對蛋白濃度進(jìn)行定量。將蛋白樣品進(jìn)行第一向等電聚焦電泳后，將膠條轉(zhuǎn)移至12.5%濃度的SDS-PAGE膠面上進(jìn)行第二向電泳，直至膠內(nèi)電泳指示劑溴酚藍(lán)跑出凝膠下緣10 min后，對凝膠進(jìn)行熒光染色。用掃描儀對熒光染色的凝膠進(jìn)行掃描后，利用圖像分析軟件進(jìn)行雙向凝膠電泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）圖像分析，通過背景消減、斑點檢測等，建立hMSCs和誘導(dǎo)成骨分化7 d的凝膠圖像，選取ratio≥2.0的差異表達(dá)候選蛋白，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析。

1.3.3質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析使用全自動斑點處理工作站對差異蛋白斑點自動進(jìn)行切割、脫色、干燥、酶解、加入基質(zhì)和質(zhì)譜靶點樣等一系列操作。將點好的質(zhì)譜靶放入質(zhì)譜儀，激光源為337 nm波長的氮?dú)饧す馄?，獲得樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析使用Profound軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎在人的NCBInr和Swiss-prot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索。對所鑒定出的蛋白，依據(jù)Gene Ontology的生物過程和分子功能分別對它們分類分析，并繪制成圖。

2 結(jié)果

2.1hMSC成骨誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)變化及成骨誘導(dǎo)分化的鑒定

在鐵路工程連續(xù)梁橋的施工控制中，自適應(yīng)控制方法也是鐵路工程連續(xù)橋梁施工控制中的重要方法之一。該方法在現(xiàn)階段鐵路工程連續(xù)橋梁施工中的應(yīng)用是最為普遍的，主要是對計算參數(shù)進(jìn)行分析，將分析后的參數(shù)結(jié)果與實際參數(shù)加以對比，了解參數(shù)偏差。在此基礎(chǔ)上，對參數(shù)進(jìn)行估計與修正，將修正和識別后的參數(shù)，應(yīng)用到下階段的實時結(jié)構(gòu)分析與往復(fù)循環(huán)中。經(jīng)過多個鐵路工程連續(xù)橋梁的施工階段，得到的參數(shù)取值會最大限度地趨于合理，且軟件模擬計算結(jié)果也會與鐵路工程連續(xù)橋梁施工的實際情況相適應(yīng)。一般來說，連續(xù)橋梁的自適應(yīng)控制法多應(yīng)用于大跨度結(jié)構(gòu)的連續(xù)橋梁施工中，且是在閉環(huán)控制方法基礎(chǔ)上展開的。

hMSCs加入成骨誘導(dǎo)液后，可見部分細(xì)胞由長梭形逐漸變?yōu)槎嘟切?，體積增大。隨著培養(yǎng)時間的延長，這種多角形細(xì)胞逐漸增多。隨著成骨誘導(dǎo)的進(jìn)行，細(xì)胞持續(xù)增殖，開始呈多層重疊生長，細(xì)胞之間界限模糊，細(xì)胞逐漸聚集形成多個散在的島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，此島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸被分泌的基質(zhì)所包埋，13～14 d左右出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，有明顯的鈣沉積。對照組加入L-DMEM完全培養(yǎng)液，細(xì)胞增殖良好，形態(tài)不變，不見致密的島狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)和鈣化結(jié)節(jié)。見圖1。

在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第10天，進(jìn)行堿性磷酸酶染色，實驗組可觀察堿性磷酸酶染色反應(yīng)為強(qiáng)陽性，細(xì)胞密集區(qū)出現(xiàn)紫黑色顆粒，胞漿內(nèi)有紫黑色的顆粒沉淀；對照組堿性磷酸酶染色陰性或弱陽性反應(yīng)，見圖2。在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后用茜素紅-S檢測鈣沉積的情況，實驗組鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，為茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色的復(fù)合物，對照組結(jié)果為陰性，見圖3。

2.2hMSCs及誘導(dǎo)成骨分化7 d的總蛋白的雙向凝膠電泳及其質(zhì)譜鑒定

軟件分析結(jié)果顯示，3張hMSCs和3張誘導(dǎo)成骨分化7 d的雙向凝膠電泳圖譜蛋白質(zhì)斑點匹配率均達(dá)到75%以上，膠的重復(fù)性好，蛋白點的分子量主要集中在20～80 kD之間，等電點主要分布在pH 4.0～8.0之間，蛋白點分離良好。

篩選ratio≥2.0的差異表達(dá)候選蛋白，經(jīng)過膠內(nèi)酶切和多肽提取后，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，70多個蛋白質(zhì)點成功的獲得了肽質(zhì)量指紋圖譜。

2.3生物信息學(xué)分析

通過數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定出52種差異蛋白質(zhì)，其中13種蛋白質(zhì)在成骨誘導(dǎo)7 d后表達(dá)明顯上調(diào)，39種蛋白質(zhì)在成骨誘導(dǎo)7 d后表達(dá)明顯下調(diào)。附表列出了這些蛋白質(zhì)的相關(guān)信息，其中后35種蛋白在相關(guān)文獻(xiàn)中已有報道[3]，從左到右依次是數(shù)據(jù)庫登入號、蛋白質(zhì)名稱及表達(dá)情況：上調(diào)/下調(diào)（U/D）。

圖1 hMSCs的體外成骨分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×40）

附表 52種差異蛋白的鑒定結(jié)果

按照Gene Ontology的分類方式對所有鑒定的蛋白質(zhì)分類繪圖，生物學(xué)過程分類中發(fā)現(xiàn)參與體內(nèi)代謝和發(fā)育過程的蛋白質(zhì)分別占37%和31%，分子功能分類中發(fā)現(xiàn)具有催化活性和結(jié)合功能的蛋白質(zhì)分別占37%和27%，見圖4。

圖2 hMSCs體外成骨分化的堿性磷酸酶染色（×100）

圖3 hMSCs體外成骨分化的茜素紅-S染色（×100）

圖4 按照Gene Ontology的分類方式對所有鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)方法己被廣泛應(yīng)用于各種組織細(xì)胞的生理病理的分子特征的分析[4-5]，本研究通過高分辨率的雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜分析以及生物信息學(xué)技術(shù)，成功的鑒定出52種差異蛋白，一些可能是在成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化過程中起關(guān)鍵作用的新蛋白。

本研究鑒定出的多種蛋白中，一些是已知的與骨發(fā)育有關(guān)的蛋白，如Annexin A2和Annexin V，研究表明，Annexin A2和Annexin V對于啟動成骨的礦化過程有著至關(guān)重要的作用[6]。Annexin A2與成骨必需的堿性磷酸酶位于細(xì)胞膜上的同一脂筏中，Annexin A2能增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性，從而有利于成骨的礦化，如果抑制Annexin A2的表達(dá)則減弱了成骨的礦化過程[7]。GENETOS等研究發(fā)現(xiàn)，Annexin A2和Annexin V可通過調(diào)節(jié)成骨前體細(xì)胞的增殖、分化以及對細(xì)胞因子的反應(yīng)而影響成骨過程[8]。成骨細(xì)胞表達(dá)Annexin A2，對于移植造血干細(xì)胞在骨髓微環(huán)境的黏附、歸巢及遷移起到重要的調(diào)節(jié)作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號傳導(dǎo)通路在成骨分化過程中有重要作用[10-11]，而ERK信號通路可激活A(yù)nnexin A2的表達(dá)[12]，可能在成骨過程中，成骨誘導(dǎo)劑通過ERK信號通路而作用與Annexin A2，從而使成骨過程順利進(jìn)行。

本研究鑒定的蛋白中，一些是與分化發(fā)育有關(guān)的蛋白，如胞內(nèi)氯離子通道蛋白4（chloride intracellular channel protein 4，CLIC4），研究表明，CLIC4參與內(nèi)皮增殖及內(nèi)皮與上皮的形態(tài)建成[13-14]，抑制CLIC4的表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[15-16]，在肌纖維母細(xì)胞的分化中，CLIC4通過p38信號通路調(diào)節(jié)此分化過程[17]，而p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨分化中發(fā)揮重要的作用[18-19]，hMSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中，細(xì)胞的數(shù)量也在不斷增加，CLIC4可能有助于細(xì)胞增殖以及通過p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而調(diào)節(jié)hMSCs成骨分化的過程。另外，新生多肽相關(guān)復(fù)合體α多肽的下調(diào)表達(dá)在hMSCs成骨分化中可能起重要作用，研究表明，caspases能促進(jìn)成骨分化[20]，caspases的激活需要Fas相關(guān)死亡域蛋白（fas-associated with death domain protein，F(xiàn)ADD）的參與，而新生多肽相關(guān)復(fù)合體α多肽與FADD的結(jié)合抑制了FADD的二聚體形成，從而抑制caspases的表達(dá)[21]，在本試驗中，新生多肽相關(guān)復(fù)合體α多肽的表達(dá)下調(diào)，可能通過調(diào)節(jié)FADD的二聚體形成、增強(qiáng)caspases的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨分化過程。對于所鑒定出的蛋白的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實驗研究。

本研究獲得了大量與成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化相關(guān)的新信息，初步建立了hMSCs誘導(dǎo)成骨分化的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，為進(jìn)一步揭示間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化的機(jī)制提供了新的思路。

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（王榮兵 編輯）

Identification and analysis of differential expressed proteins in osteoblast differentiation from human bone marrow mesenchymal stem cells*

Ai-xia ZHANG1,Wei-hua YU2,Tao WANG1,Bao-feng MA2
(1.Department of Biological Engineering,College of Life Sciences,Jiaying University,Meizhou, Guangdong 514015,P.R.China;2.Center for Stem Cell and Tissue Engineering,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510080,P.R.China)

【Objective】To research human bone marrow mesenchymal stem cells(hMSCs)differentiation along osteoblasts to find the important functional proteins and elucidate the molecular mechanism in the process of differentiation into osteoblasts.【Methods】The total protein extracts were obtained with cell lysis buffer from undifferentiated hMSCs and osteogenic induced hMSCs on day 7.Using proteomic approaches based on two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)and 2-DE gel analysis software,differently expressed protein spots were selected after being recognized and tested.The selected differently expressed protein spots were identified and analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and bioinformatics.【Results】Through MALDI-TOF-MS analysis and database searching,52 proteins were identified including 13 up-regulated and 39 down-regulated in osteogenic induced hMSC for 7 days relative to undifferentiated hMSCs.The identified proteins were grouped by Gene Ontology according to biological process and molecular function.【Conclusion】The identified differential proteins that maybe play important roles in osteogenic differentiation of hMSCs provide a comprehensive reference to understand molecular mechanism of osteogenic differentiation.

human bone marrow mesenchymal stem cells;osteogenic differentiation;proteomics

R329.2

A

1005-8982（2015）25-0016-05

2014-12-20

國家自然科學(xué)基金資助項目（No：81000681；No：81000177）